大鼠移植性肺癌模型的建立方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及疾病的實驗動物模型構建領域，具體涉及一種大鼠移植性肺癌模型的建立方法。
【背景技術】
[0002]目前，隨著中國空氣污染程度的加重，尤其是霧霾肆虐給國人健康帶來嚴重隱患。世界衛生組織下屬國際癌癥研宄機構指出，有充足證據顯示，霧霾還是誘發肺癌的重要因素。肺癌已經成為世界上導致腫瘤患者死亡率最高的癌癥之一，被衛生部列為今后癌癥防治的重點。但由于肺癌臨床表現復雜，難以早期發現和診斷等使得肺癌療效得不到提高。因此，復制出與人類肺癌發病機制、發展過程相似的動物模型是腫瘤學研宄必不可少的手段之一O
[0003]目前肺癌動物模型的制備方法多采用誘發性、移植性或轉基因動物模型。移植性動物模型又可分為原位移植和異位移植，其中異位移植因其方法簡便、成模率高而被廣泛應用，但該類模型適用于抗癌藥物療效檢測，不適合用于腫瘤發生和形成機制的研宄。原位移植動物模型被認為是目前比較理想的模型，主要通過將癌細胞直接注射到肺部支氣管復制肺癌原位模型，該模型能較真實地模擬肺癌患者的臨床特征，但手術操作難度較大，動物死亡率高，成瘤率低。在人肺癌移植動物模型研宄中，經常用基因工程改造鼠如免疫缺陷裸鼠、雖然該類免疫缺陷鼠能解決人肺癌細胞在動物體內生長問題，但由于肺癌微環境中人鼠混合細胞不利于研宄癌細胞轉移。此外飼養比較苛刻等因素制約該類模型的廣泛應用。Walker-256是目前廣泛認可的大鼠可移植性腫瘤細胞株，植入體內能較好地模擬人類惡性腫瘤的膨脹性和浸潤生長方式。應用Walker-256細胞植入大鼠支氣管，構建原位性肺癌模型，此造模方法對實驗技術要求較高，術后動物死亡率高，在實際應用中成模率低。此外，雖然采用尾靜脈注射能降低死亡率，提高成膜率，但是存在病灶部位不確定，病灶數目多(右左肺都有)，并向在其他臟器轉移等缺陷。本發明要解決的技術問題是針對現有技術的不足，用Walker-256細胞準確移植到大鼠左肺中部，形成病灶部位明確，病灶大小可控的大鼠移植性肺癌模型及其制備方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種具有單一病灶且部位確定的大鼠肺癌模型，為研宄惡性肺癌生長、轉移、藥物療效評價、藥物篩選、肺部疾病成像儀器的研制和精確放療的療效評估及監測提供動物模型和研宄工具。
[0005]本發明的另一目的是提供建立不同體積的肺癌動物模型的方法。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明提供如下方案:
[0007]一種大鼠移植性肺癌模型的建立方法，包括如下步驟:
[0008](I)Walker-256細胞腹水的制備:從液氮罐中取出凍存的Walker-256細胞，置于37土 1°C水浴鍋中迅速溶化，完全溶化后置于冰上，用注射器吸取細胞懸液，注射到3-4周齡且體重在SO-1OOg的雄性SD大鼠腹腔中，待第7天后抽取腹水；然后用生理鹽水稀釋成不同濃度；
[0009](2)Walker-256細胞接種到SD大鼠肺部:SD大鼠麻醉后，固定在操作臺上，對大鼠胸腔左部進行碘伏消毒，把Walker-256細胞懸液與等體積的Matrigel在冰上混勻形成混合液，然后在左肺肋5?6之間用Iml注射器將混合液緩慢注入左肺部，進針深度為0.6-0.8cm，注射完后停針10s，緩慢拔出，大鼠生長14天以后，得到移植性肺癌模型。
[0010]優選地，當接種的混合液為10 UL時，其中含有的Walker-256細胞的數量大于
1X 15時肺部成瘤率達到100%。
[0011]優選地，步驟⑵中通過CT引導建立起細針進入大鼠肺內部的準確進針深度為0.6-0.8cm。
[0012]優選地，所述的步驟(2)中的大鼠為:裸大鼠，步驟(2)中的癌細胞為:人肺癌細胞。
[0013]優選地，當注射混合液的體積為20yL，其中含有Walker-256細胞的數量為
2X 15時，14天后，主病灶直徑為0.5cm ;當注射混合液的體積約為15 μ L，其中含有Walker-256細胞的數量為1.5X 105，14天后，主病灶直徑約為0.35cm ;當注射混合液的體積為10 μ L，其中含有Walker-256細胞的數量為I X 15,14天后，主病灶直徑約為0.2cm。
[0014]本發明采用肺部原位注射Walker-256細胞建立移植性肺癌模型，觀察大鼠的成瘤及生存情況，為進一步的腫瘤實驗研宄奠定基礎，本發明模型的建立方法具有如下優占.V.
[0015]1、本發明采用鼠源的腫瘤細胞株Walker-256，預先在大鼠腹腔擴增，容易操作，獲得細胞活性高、數量多，能減少免疫排斥，能再短時間內形成明顯的腫瘤病灶。
[0016]2、利用Matrigel和細胞懸液等體積混合后，接種到大鼠肺部，(低溫下Matrigel成液體，室溫下成固定的特性),Matrigel能把Walker-256固定在肺內部，減少接種細胞外溢，提搞成瘤率，形成病灶單一，便于觀察腫瘤的生長和轉移。
[0017]3、本發明對大鼠損傷小，僅需要常規麻醉大鼠，直接把Walker-256細移植到肺內部，腫瘤病灶部位明確，病灶單一而且病灶大小可控，避免了要支氣管內接種對實驗技術要求高，術后動物死亡率高，成模率低的缺陷和尾靜脈注射時左左肺內病灶區較多，容易在向其它臟器轉移的缺陷，此外該方法還具有制備簡單，成瘤率高，動物死亡率低等優點。
[0018]4、本發明利用通過CT引導建立起細針進入大鼠肺內部的準確進針深度0.6-0.8cm之間，減少因進針過深穿透肺部或進針不足而引起的成瘤率低的問題。
[0019]5、本發明的動物模型可作為抗肺癌藥物篩選的試驗動物，通過觀察肺部腫瘤大小，向其它器官轉移及癌細胞侵襲能力，對藥物的療效和安全進行體內實驗評價。
[0020]6、本發明的動物模型可作為針對肺癌放療效果，對荷瘤肺部進行照射，通過不同照射劑量、方式以及與藥物的組合應用，現實化療效果的最大化以減少對正常肺部的放射肺損傷。
[0021]7.、由于呼吸運動的存在，降低了肺部腫瘤放射治療的準確性，本發明的不同病灶大小的肺癌動物模型可作目前精確放療過程中體位固定摸索，計算肺部放療靶區中心點定位差異的實驗動物模型。
【附圖說明】
[0022]圖1為Walker-256細胞腹水擴增和細胞形態觀察圖:
[0023]其中:圖1A為Walker-256細胞注射到大鼠腹腔7d后，大鼠的圖片；
[0024]圖1B為抽取大鼠腹水圖；
[0025]圖1C為顯微鏡下抽取的大鼠腹水中Walker-256細胞形態圖。
[0026]圖2為大鼠肺部接種混合液14d后CT掃描圖:
[0027]其中:圖2A為第一空白對照組大鼠接種混合液14d后CT掃描圖；
[0028]圖2B為第二空白對照組大鼠接種混合液14d后CT掃描圖；
[0029]圖2C為第一處理模型組大鼠接種混合液14d后CT掃描圖；
[0030]圖2D為第二處理模型組大鼠接種混合液14d后CT掃描圖。
[0031]圖3肺部進行組織切片HE染色后觀察圖:
[0032]其中:圖3A為空白對照組的大鼠肺部HE染色后觀察圖；
[0033]圖3B、C、D為處理模型組的大鼠肺部HE染色后觀察圖；
[0034]圖4為接種不同體積混合液的大鼠肺部腫瘤示意圖:
[0035]其中:圖4A為接種20 μ L混合液的大鼠肺部腫瘤示意圖；
[0036]圖4Β為接種15 μ L混合液的大鼠肺部腫瘤示意圖；
[0037]圖4C為接種1yL混合液的大鼠肺部腫瘤示意圖。
【具體實施方式】
[0038]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明如下。
[0039]實施例1:大鼠抑制性肺癌模型的建立方法
[0040](I)材料來源:
[0041]SD大鼠:雄性SD大鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心，無特定病原體。
[0042]大鼠Walker-256 細胞:購于 ATCC。
[0043](2)大鼠抑制性肺癌模型的建立方法
[0044]第一步:Walker_256細胞腹水的制備
[0045]從液氮罐中取出凍存的Walker-256細胞，置于37°C水浴鍋中迅速溶化，完全溶化后置于冰上，用2ml注射器吸取