一種生物大分子微膠囊產品及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明提供一種生物大分子微膠囊的制備方法，涉及到酵母細胞的培養、處理、微膠囊制備及封孔的方法，更進一步涉及通過該方法所制備的生物微膠囊壁材和生物大分子微膠囊產品。
【背景技術】
[0002]微膠囊作為一項能夠改善功能性物質性能的新技術具有廣闊的應用前景。酵母細胞大小均勻，容易培養，價廉，其細胞壁和細胞膜構成的雙層囊腔結構，是包埋物質的良好材料。法國專利FR2179528報道了工業用酵母經過質壁分離劑處理后，包埋了氯化釹、氯化鎂和洋蔥提取物；美國專利USA 4001480介紹了一種利用在低氮高碳源培養基上培養的脂肪含量高達40?60%的酵母細胞包埋油溶性化合物的方法；專利EP-0085805A1利用一種既能溶于油又能溶于水的公共溶劑，找到了一種以脂肪含量高于10%的酵母菌制備微膠囊的方法；而專利EP 0242135A2采用將酵母細胞放在含有囊心的濃溶液或分散液中溶脹，在室溫條件下攪拌進行擴散滲透的方法，提供了一種脂肪含量低于10%的酵母細胞作為微膠囊壁材而無需公共溶劑的微膠囊化方法。EP 0414282A1和0414283A1提供了一種將漂白劑和紡織柔軟劑中的芳香類物質包埋于酵母細胞中的方法。WO 93/11869則先用H2O2除臭后再制成了液體漂白催化劑的微膠囊。WO 94/22572公開了一種先將待包埋物質的溶液進入到細胞中，然后通過物理或化學方法使待包埋物殘留其中的制備生物微膠囊的方法。2000年成立的Fluid Technologies Plc.公司專門生產風味物質的酵母微膠囊，日本也開發成功了油脂的酵母微膠囊產品。
[0003]專利號為ZL2007101375531的中國發明專利提供一種制備安全無毒性能優良的微膠囊壁材的方法。通過對酵母細胞進行改性后所制備的微膠囊壁材既可用于脂溶性物質的包埋，又能用于水溶性小分子物質的微膠囊化。專利號為ZL2007101375527中國發明專利公開了一種小分子抗氧化劑生物微膠囊的制備方法，不僅制備過程簡便，而且在包埋過程中不會發生化學變化。
[0004]上述專利文獻均是以酵母細胞為壁材對小分子物質進行了成功包埋。但只有流體力學半徑(Rh)小于0.81nm(或分子量低于620Da)的物質以及分子量低于400kDa的球形蛋白能夠自由通過酵母細胞壁，而質膜卻限制了 Rh大于0.42nm或分子量高于IlODa的物質的穿越。現有文獻中還未見利用酵母細胞來制備生物大分子如多肽蛋白類藥物微膠囊的方法。
[0005]多肽蛋白類藥物具有活性高、特異性強、毒性低等特點，可有效治療癌癥、自身免疫性疾病及高血壓等疑難病，但其口服生物利用度通常低于I %，其常規給藥方式均以注射為主。將多肽蛋白類藥物制成酵母細胞微膠囊后，不僅能有效防止藥物在體內快速降解，提高藥物的穩定性，而且還能提高治療的有效性和安全性，降低成本。
【發明內容】
[0006]本發明的技術原理是通過化學處理將酵母細胞內部空化后，在高溫下使酵母細胞本身的水解酶系失活，再重新懸浮在氫氧化鈉溶液中進行振蕩處理24-48小時后，與生物大分子溶液高頻度接觸，使生物大分子通過擴散或滲透進入到酵母細胞中制得生物大分子酵母細胞微膠囊。進一步采用陽離子聚合物進行封孔，可以得到緩釋性能更佳的生物大分子酵母細胞微膠囊產品。
[0007]因此，本發明的第一個目的是提供一種制備適于生物大分子包封的生物微膠囊壁材的方法，包括:
[0008](I)采用酵母細胞為出發菌株，經斜面培養和種子培養后，接種在發酵培養基中進行搖瓶培養；
[0009](2)將所得的酵母細胞離心，洗滌后，重新懸浮在具有促進酵母細胞自溶的化學試劑中，在40?60°C的溫度下進行振蕩處理24?48小時后，升溫至85°C進行滅酶處理5?20分鐘。離心、洗滌后凍干或再在20?40°C下用氫氧化鈉溶液進一步處理24?48小時，離心、洗滌后，冷凍干燥，即得到所述的生物微膠囊壁材。其中所述的化學試劑任一選自吐溫-80或TritonX-100、溴化十六烷基三甲基銨、十二烷基硫酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、氯化鉀及氯化鈉。
[0010]應當指出:加入化學試劑的作用在于促進酵母細胞自溶，如果加入高濃度的化學試劑則反應時間更短，如果加入低濃度的化學試劑則反應時間更長。因此在合適的濃度范圍內，加入不同濃度的化學試劑，本領域技術人員顯然可以通過控制時間長短來達到預期效果。
[0011]在一個具體實施方案中，所述的吐溫-80的加入重量為0.1?5% ;或
[0012]所述的TritonX-1OO的加入重量為0.1?5% ;或
[0013]所述的溴化十六烷基三甲基銨的加入重量為0.1?5% ;或
[0014]所述的十二烷基硫酸鈉的加入重量為0.1?5% ;
[0015]所述的鹽酸的加入重量為0.5?10% ;或
[0016]所述的氫氧化鈉的加入重量為0.5?10% ;或
[0017]所述的乙醇的加入重量為I?20% ;或
[0018]所述的氯化鈉的加入重量為I?20% ;或
[0019]所述的氯化鉀的加入重量為I?20%。
[0020]在另一個具體實施方案中，搖瓶培養的步驟如下:斜面種子活化4小時后接入種子培養基，培養24小時后再按10%的接種量接入裝有50mL發酵培養基的250mL搖瓶中進行發酵培養，發酵時間24小時，發酵溫度28-32°C，轉速180r/min。
[0021]在另一個具體實施方案中，酵母細胞處理的步驟如下:培養的酵母細胞離心、洗滌后，重新懸浮于0.1?20%的化學試劑中，在40?60°C下處理24?48小時，離心、洗滌后，冷凍干燥。
[0022]在另一個具體實施方案中，酵母細胞處理的步驟如下:培養的酵母細胞離心、洗滌后，重新懸浮于0.1?20 %的化學試劑中，在40?60 °C下處理24?48小時后，升溫至85 °C進行滅酶處理5?20分鐘。離心、洗滌后，冷凍干燥。
[0023]還在另一個具體實施方案中，酵母細胞處理的步驟如下:培養的酵母細胞離心、洗滌后，重新懸浮在0.1?20%的化學試劑中，在40?60°C下處理24?48小時后，升溫至85°C進行滅酶處理5?20分鐘。離心、洗滌后，再在20?40°C下以0.1?10%的氫氧化鈉處理24?48小時，離心、洗滌后，冷凍干燥，即得到所述的生物微膠囊壁材。
[0024]在一個具體實施方案中，所述的菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeHan.)，斜面培養基為PDA培養基，種子培養基和發酵培養基為高糖培養基，組成為:蔗糖、酵母浸出物、無機氮源采用中心組合設計優化，再補充必要的礦物質。
[0025]在另一個具體實施方案中，所述的種子培養基和發酵培養基均為YPD培養基，組成如下:蛋白胨20.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、添水至lOOOmL，pH4_5。
[0026]在另一個具體實施方案中，所述的種子培養基和發酵培養基均為產脂培養基，組成如下:蛋白胨3.0g、酵母提取物8.0g、鹿糖170.0g、添水至1000mL。
[0027]還在另一個具體實施方案中，種子培養基和發酵培養基都為豆芽汁蔗糖培養基，配制如下:取黃豆芽200.0g，洗凈，放入水中煮沸30min，用紗布過濾，取豆芽汁加蔗糖30.0g,添水至 100mL,調節 pH = 7.2。
[0028]本發明的第二個目的是提供利用所制備的生物微膠囊壁材制備生物大分子酵母細胞微膠囊的方法，包括:
[0029]步驟(1)-(2)，與前述相同；
[0030](3)將凍干后的酵母細胞微膠囊壁材與生物大分子溶液在20?40°C下高頻度接觸24?48小時制備生物大分子酵母細胞微膠囊。
[0031](4)如果需要，采用高效液相色譜法測定微膠囊中生物大分子的包埋度。
[0032]其中，包埋度定義(下同):包埋度(％)=實際包埋量/微膠囊重量X 100%
[0033]高頻度接觸定義(下同):以可以實現溶液組分充分混和的轉速進行振蕩的頻度。本領域公知的轉速50rpm/min以上或加壓2MPa以上，例如50?75rpm/min、75?200rpm/min或200rpm/min以上的振蕩頻度。
[0034]在一個具體實施方案中，利用所述的壁材制備生物大分子微膠囊的步驟如下:將Ig酵母細胞壁材與I?20mL I %的生物大分子溶液在20?40°C高頻度接觸進行包埋。24小時后取出，離心，洗滌除去表面未包埋的生物大分子，冷凍干燥。
[0035]在另一個具體實施方案中，所述的生物大分子為1%牛血清白蛋白(BSA)，所述的溶液為水溶液，所加入的1% BSA的量為I?20mL。
[0036]本發明的第三個目的是提供對生物大分子酵母細胞微膠囊進行封孔的方法。包括:
[0037]步驟(1)-(3)，與前述相同；
[0038](4)將酵母細胞微膠囊壁材與生物大分子溶液高頻度接觸所得微膠囊與陽離子聚合物溶液在20?40°C下繼續高頻度接觸24?48小時進行封孔，離心、洗滌后，冷凍干燥即得最終的生物大分子酵母細胞微膠囊產品。
[0039](5)如果需要，采用高效液相色譜法測定微膠囊中生物大分子的包埋度。
[0040]在一個具體實施方案中，微膠囊的封孔步驟如下:在20?40°C下，待Ig酵母細胞與I?20mL I %的生物大分子溶液高頻度接觸24時完成包埋后，加入陽離子聚合物溶液，使其最終濃度為0.1?2%，繼續高頻度接觸24小時，離心，洗滌除去多余的陽離子聚合物，冷凍干燥。
[0041]在另一個具體實施方案中，所述的陽離子聚合物為高分子量殼聚糖，分子量為?1.5X105，脫乙酰度>90%，所述的溶液為1% HAc溶液。
[0042]在另一個具體實施方案中，所述的生物大分子溶液為1% BSA水溶液，所述的陽離子聚合物溶液為殼聚糖(分子量為?1.5 X 105，脫乙酰度>90%，浙江玉環化工廠)的1%HAc溶液。在另一個具體實施方案中，所加入的1% BSA的量為I?20mL，所加入殼聚糖溶液的量為使其最終濃度為0.1?2%。
[0043]本發明的第四個目的是提供通過上述方法所制備的酵母細胞生物微膠囊壁材。
[0044]本發明的第五個目的是提供通過上述方法所制備的生物大分子微膠囊產品。
[0045]在一個具體實施方案中，所制備的生物大分子微膠囊是蛋白類生物微膠囊，其中涉及的蛋白質為BSA，優選I %的BSA，涉及的溶液為水溶液。
[0046]在另一個具體實施方案中，進行封孔的是BSA酵母細胞微膠囊，其中涉及的陽離子聚合物為殼聚糖，分子量為?1.5 X 105，脫乙酰度>90%，優選0.5%的殼聚糖(浙江玉環化工廠)，涉及的溶液為I % HAc溶液。
[0047]技術效果:
[0048](I)以常見的酸、堿、鹽、有機溶劑和表面活性劑對酵母細胞進行化學處理，不僅能使酵母細胞內部空化，而且能部分降解酵母細胞壁和細胞膜，從而有效增大酵母細胞孔徑，能用于生物大分子的包封，生物大分子的包埋度可以高達10.09%。
[0049](2)采用升溫對化學處理后的酵母細胞本身的水解酶系進行滅活處理，能夠防止酵母細胞壁材對微膠囊中生物大分子的降解作用，從而保持生物大分子的穩定性。經過滅酶處理后，酵母