弓形體屬的減毒株用于預防或治療隱孢子蟲病的用圖
【專利說明】弓形體屬的減毒株用于預防或治療隱孢子蟲病的用途
[0001] 本發明涉及寄生蟲減毒株用于預防或治療與頂復門動物相關的病理學狀況的用 途。
[0002] 頂復門動物是大多數地細胞內的專性寄生蟲，其具有可以涉及數個宿主的生活 史。這些寄生蟲的門細分為幾個科。
[0003] 鼠弓形體（Toxoplasma gondii (T. gondii))屬于肉抱子蟲科（Sarcocystidae) 〇 該原生動物以隨著宿主和感染階段而變化的三種感染形式存在：
[0004] 魯速殖子：在中間宿主（即所有恒溫動物）和終宿主（即貓科動物，特別是貓）的 細胞中無性繁殖的增殖和感染形式，
[0005] 魯慢殖子：包含在包囊中的該寄生蟲的具有緩慢分裂和低代謝水平的形式，
[0006] ?子孢子：包含在卵囊中的形式，其產生自該寄生蟲在終宿主（即貓和其他貓科 動物）的腸中的有性繁殖。
[0007] 貓（該寄生蟲的終宿主）通過攝入包含包囊（或速殖子，如果動物處于弓形體病 的急性期）的被寄生的獵物或通過攝入卵囊而受到感染。在經由配子囊于貓科動物的腸中 進行有性繁殖后，卵囊被散布到環境中。這些卵囊在外部環境中形成孢子，并且其致病性持 續至少一年。在卵囊攝入后，所釋放出的子孢子感染終宿主或中間宿主的腸細胞并轉變為 在生物體中散布的速殖子。在免疫系統的壓力下，速殖子被包于包囊內，具有對于中樞神經 系統、視網膜或肌肉的優先向性。攝入含包囊的組織是污染終宿主和中間宿主的第二個原 因。在攝入包囊后，慢殖子被釋放并感染腸上皮細胞，并且轉變為在宿主中散布的速殖子。
[0008] 鼠弓形體株系按照其體內毒力程度來進行分類型株系（即株系RH)是高毒力 的，而II型（即株系ME49、76K或Pru)和III型（即株系CEP或M7741)株系是毒力較小 的并且通常建立慢性感染。此外，鑒定出了許多不能歸于這三種主要類型的非典型株系， 尤其是在非洲和南美洲（Howe DK 等人，1995, J. Infect. Dis.，171，1561-1566 ;Rajendran C 等人，2011，Infect. Genet. Evol.，12, 359-368 ;Mercier A 等人，2010, PLoS Negl. Trop. Dis. , 4, e876) 〇
[0009] 最近，通過使編碼蛋白TgMICl和TgMIC3的兩個基因無效而制作出了鼠弓形體 (對弓形體病負有責任的寄生蟲）的減毒活株系（EP 1 703 914 Bl和US 7, 964, 185 B2/ C6r6de 等人，2005, J. Exp. Med. ,201:453-63)。稱為 Toxo micl-3 KO 的該株系產生針 對鼠弓形體的強烈且特異的免疫應答，并且使得能夠在小鼠中（]S11ia以等人，2005, J. Infect. Dis.，194:1176-1183)和還有在母羊中（Mevelec 等人，2010, Vet. Res. ,41:49)預 防以后感染的效應。還已經證明，體內毒力僅非常少地受到TgMICl或TgMIC3的孤立失活 的影響；相反地，通過這兩種蛋白質的同時失活強烈地降低了體內毒力，這表明了這兩種蛋 白質的協同作用（C6i^de 等人，2005J. Exp. Med.，201:453-63)。
[0010] 犬新孢子蟲（Neospora caninum)是對新孢子蟲病負有責任的細胞內寄生蟲。它 也屬于肉孢子蟲科。犬新孢子蟲的生活史非常近似于鼠弓形體的生活史，具有兩個不同的 階段：在終宿主（即犬科動物，特別是狗）中的有性階段，其導致包含子孢子的卵囊的產生， 所述卵囊被排到糞便中；和在中間宿主（即綿羊、山羊、牛、馬科動物等）中的無性階段，其 導致速殖子的產生和隨后包含慢殖子的包囊的產生。
[0011] 更近來，獲得了犬新孢子蟲的減毒活株系，株系Neo ncmicl-3KO,其已通過同源 重組而對于基因ncmicl和ncmic3而言被無效。在該株系中，用允許對于乙胺喃啶的抗性 的盒DHFR替代基因ncmic3,和用賦予寄生蟲以對于氯霉素的抗性并使寄生蟲發熒光的盒 CAT-GFP替代基因ncmicl。該寄生蟲不再表達蛋白NcMICl和NcMIC3。已顯示，該突變株具 有感染和免疫原特性，從而賦予哺乳動物以針對新孢子蟲病的有害效應的疫苗保護。
[0012] 鼠弓形體和犬新孢子蟲共同具有以多個步驟侵入宿主細胞的特殊過程，從而導致 形成寄生泡，在所述寄生泡中寄生蟲進行繁殖和發育。
[0013] 隱孢子蟲科（Cryptosporidiidae)是另一個屬于頂復門的科，并且對隱孢子蟲病 負有責任，所述隱孢子蟲病是極其常見的疾病，其通過存在于它們食物中的寄生蟲的攝入 而影響尤其是人和許多動物物種，包括農用動物（綿羊、山羊、牛等）。在這之后，寄生蟲在 腸中進行繁殖，首先按照無性方式，然后其次按照有性方式。被污染的個體排出并再次散布 寄生蟲，其因此污染了它們的環境（即牧場、水等）。
[0014] 已經鑒定出了隱孢子蟲科的數個物種，其中小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum)是最常見和最具毒力的一種。
[0015] 在人中，隱孢子蟲病是一種通常良性的疾病。然而，該疾病（其發病率每年增長， 尤其在美國）的后果在幼兒和受到免疫抑制的人（特別是被HIV病毒感染的患者）中可能 是極其嚴重的。因此，在這些群體內，隱孢子蟲病是造成嚴重腹瀉的原因，所述嚴重腹瀉可 以產生大量脫水，甚至如果沒有適當的治療，可以產生個體死亡。
[0016] 在有免疫能力的成年動物中，隱孢子蟲病也是良性的。相反地，在年齡為幾天至幾 周并且其免疫系統未成熟的非常年幼的動物中，隱孢子蟲病通常具有嚴重的后果。因此，隱 孢子蟲屬物種（Cryptosporidum spp)，尤其是小隱孢子蟲，被證實是新生動物腹瀉的最常 見的病因學因子，所述新生動物腹瀉產生重大的生長遲緩，并且如果沒有適當的治療，對于 動物來說可以是致命的。
[0017] 新生動物腹瀉對牛、綿羊和山羊的飼養者來說構成了持久不變的威脅，并且意味 著巨大的經濟損失，這是由于因生長遲緩、新生動物死亡、獸醫介入以及治愈性治療和補 液的花費而引起的收入損失。新生動物腹瀉的病因學經常是事實上對這些癥狀負有責任 的多重的多種感染因子，尤其是輪狀病毒、冠狀病毒、BVDV病毒（牛病毒性腹瀉病毒）、 大腸桿菌（Escherichia coli)和當然還有小隱孢子蟲。這些各種不同的感染因子在反 芻動物的新生動物腹瀉中的作用是難以估計的，因為很少進行診斷并且經常存在多重感 染。然而，小隱孢子蟲目前被認為是新生動物腹瀉的主要因素（de Graaf等人，1999, Int. J. Parasitol. ,29:1269-1287)。因此，在患有新生動物腹瀉的小牛上進行的研宄已表明，它 們之中的40%被小隱孢子蟲感染并且其中3/4不具有任何其他感染因子（位于布魯塞爾 的"獸醫學和農業化學研宄中心（Veterinary and Agrochemical Research Centre)"的數 據）。
[0018] 為了減少癥狀的強度和持續時間，已在各種不同的模型中評價了許多分子，但是 沒有一個給出令人滿意的結果。因此，在家養反芻動物中，僅乳酸鹵夫酮（HaloCur?) 和巴龍霉素給出了令人感興趣的結果，但并不允許寄生蟲的完全控制（Chartier，2002, Le Point v6t6rinaire Pathologie ovine et caprine, 112-117)。在人中，特別是對于治療 艾滋病患者，通常的治療基于巴龍霉素（Humatin)或硝唑沙奈的使用。這兩種分子具有相 似的效力，但是硝唑沙奈被判斷具有較低毒性。此外，最近制作出了對于鼠弓形體和犬新孢 子蟲的鈣依賴性蛋白激酶特異的抑制劑（WO 2011/094628 Al)。它們尤其是屬于吡唑并嘧 啶類和咪唑并[1，5-a]吡嗪類的化合物。這些抑制劑影響所述寄生蟲的侵入和增殖的能 力，而不干擾宿主細胞的生物學活性。
[0019] 總之，無論在人中還是在動物中，目前都不存在任何使得能夠有效地對抗隱孢子 蟲病的特異性治療，并且僅有基于嚴格衛生守則的預防使得能夠減少攝入被小隱孢子蟲污 染的水或食物。
[0020] 因此，對于用于在哺乳動物（尤其是具有未成熟或缺陷的免疫系統的哺乳動物） 中預防和治療隱孢子蟲病的試劑存在著真正需要。事實上，由于感染可以在最初幾天期間 發生，新生動物具有處于發育過程中的免疫系統，這使得在年幼動物中的傳統的疫苗接種 方案是不可能的。因此，在高度地方性流行的地區中用殺死的寄生蟲在新生小牛上進行的 預防試驗未顯示任何顯著的保護作用（Harp等人，1996, Am. J. Vet. Res. ,57:1586-1588 ; Harp 等人，1998, J. Dairy. Sci. 81:289-294)。
[0021] 然而，已證明，針對小隱孢子蟲的免疫應答導致發展出Thl類型的保護性應答，其 具有細胞因子IL-12和IFN-Y的大量產生。還證明，這些細胞因子能夠減低感染的影響 (Lacroix 等人，2001，Infect. Immun. ,69:1635-42)。
[0022] 本發明的目標之一是提供免疫刺激劑，其能夠在新生動物中誘導具有IL-12和 IFNy的產生的非特異性免疫應答。
[0023] 本發明的另一個目標是提供免疫刺激劑，其能夠限制小隱孢子蟲對于哺乳動物 (人或動物）的感染的效應。
[0024] 本發明的另外一個目標是提供針對隱孢子蟲病的預防性治療，尤其是疫苗。
[0025] 本發明的目標在于從其天然環境中分離并具有免疫刺激效應的選自弓形體屬物 種（Toxoplasma spp)或新孢子蟲屬物種（Neospora spp)的肉孢子蟲科株系，其用于在哺 乳動物中預防或治療與隱孢子蟲科的頂復門動物相關的病理學狀況之中使用。
[0026] 本發明的目標在于從其天然環境中分離并具有免疫刺激效應的選自減毒弓形體 屬物種或減毒新孢子蟲屬物種的肉孢子蟲科減毒株系，其用于在哺乳動物中預防或治療與 隱孢子蟲科的頂復門動物相關的病理學狀況之中使用。
[0027] 本發明的目標在于從其天然環境中分離并具有免疫刺激效應的選自弓形體屬物 種或新孢子蟲屬物種的肉孢子蟲科株系，其用于在哺乳動物中預防或治療與隱孢子蟲科的 頂復門動物相關的病理學狀況之中使用，所述株系具有相對于誘導與弓形體屬物種或新孢 子蟲屬物種相關的病理學狀況的野生株而言減弱的毒力。
[0028] 作為例子但這并不限制本發明的范圍，頂復門動物的此類野生株可以通過RH類 型的鼠弓形體的強毒株（對于弓形體病）或者NCl類型的犬新孢子蟲的強毒株（對于新孢 子蟲病）來進行舉例說明。
[0029] 本發明的目標在于從其天然環境中分離并具有免疫刺激效應的選自弓形體屬物 種或新孢子蟲屬物種的肉孢子蟲科株系，其用于在哺乳動物中預防或治療與隱孢子蟲科的 頂復門動物相關的病理學狀況之中使用，所述株系具有相對于強毒株（即具有與從其獲得 毒力減弱的株系的那個株系的毒力基本上相同的毒力的株系）而言減弱的毒力。
[0030] "免疫刺激"意指弓形體屬物種或新孢子蟲屬物種的株系誘導宿主免疫系統的早 期激活的能力。該激活牽涉免疫系統的組分例如干擾素、細胞因子、吞噬細胞、NK細胞（天 然殺傷細胞）、樹突細胞和補體系統，其將會非特異地作用于所靶向的病原體。該免疫刺激 并不基于適應性免疫的建立。
[0031] "預防"意指目的在于阻止疾病出現或蔓延的預防方法。它尤其涉及保護傾向于染 上和發展出與隱孢子蟲科的頂復門動物相關的病理學狀況的個體。這樣的個體尤其為具有 未成熟的免疫系統的新生動物或這具有免疫系統功能障礙的個體。它還涉及保護暴露于來 自其環境的污染風險的哺乳動物。
[0032] "治療"不僅意指病理學狀況的進展的抑制，而且還意指與該病理學狀況相關的癥 狀的減輕。治療的目的在于減小癥狀的幅度直至其完全消失，從而允許個體恢復正常的生 理狀態。
[0033] "哺乳動物"意指人類、某些農用或飼養動物和某些伴侶動物。
[003