用于治療氧化應激的納米二氧化鈰的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2012年6月13日提交的臨時申請序列號 61/689,806(NAN0CERIA FOR THE TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS)，2012 年6 月 18 日 提交的臨時申請序列號 61/690, 100 (NANOCERIA FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS)，2012 年 10 月 12 日提交的臨時申請序列號 61/795, 241 (BIOLOGICAL EFFECTS OF NANOCERIA IN A MODEL OF MULTIPLE SCLEROSIS)以及 2012 年 11 月 16 日提 交的臨時申請序列號 61/796, 639 (NANOCERIA FOR THE REDUCTION OF OXIDATIVE STRESS) 的優先權，其全部公開內容通過引用整體并入本文。
技術領域
[0003] 本發明一般性地涉及納米醫學領域的改進。特別地，本發明涉及用生物相容材料 制備的含鈰納米顆粒，制備所述納米顆粒的方法，以及所述納米顆粒預防和治療炎癥及氧 化應激相關事件和疾病的用途。
【背景技術】
[0004] 自由基氧化應激在許多人類疾病尤其是神經退行性疾病的發病機理中起著主要 作用。因此，使用可降低特定自由基物類的抗氧化劑進行治療在理論上可防止組織損傷并 改善存活和神經結果兩者。生理環境中的自由基通常可分為活性氧類（reactive oxygen species，R0S)或活性氮類（reactive nitrogen species，RNS)。自由基是具有高度活性的 化學物類并且易于在亞細胞水平上與蛋白質、脂類和核酸反應，從而導致各種疾病的發展。
[0005] 在納米醫學中使用納米二氧化鋪的起源可追溯到Bailey和Rzigalinski的開 創性工作，其中觀察到將超細鈰氧化物顆粒施用于培養的腦細胞中大大增強了細胞存活 能力，如 Rzigalinski 在 Nanoparticles and Cell Longevity, Technology in Cancer Research&Treatment 4(6)，651_659(2005)中所描述的。更特別地，當使用由反膠束微乳 化技術合成的2至10納米（nm)大小的鈰氧化物納米顆粒處理體外大鼠腦細胞培養物時， 其表現出長約3至4倍的存活時間，如Rzigalinski等于2003年9月4日提交的美國專利 7, 534, 453中所報道的。鈰氧化物納米顆粒為暴露于由過氧化氫或紫外線暴露所產生的致 死劑量自由基的經培養腦細胞提供了相當大的保護。此外，據報道，鈰氧化物納米顆粒在鼠 體內是相對惰性的，具有較低毒性（例如，尾部靜脈注射不產生毒性作用）。雖然沒有報道 體內的醫學益處，但是假設了用這些二氧化鈰納米顆粒進行治療的益處，包括減少與創傷、 移植、關節炎、關節病、血管病、組織衰老、中風和創傷性腦損傷相關的炎癥。
[0006] 然而，Rzigalinski等隨后在WO 2007/002662中報道了這些特定納米二氧化鈰顆 粒的許多問題。通過這種反膠束微乳化技術制備的納米二氧化鈰有幾個問題：（1)粒徑不 能較好地控制在所報道的2至10納米（nm)范圍內，使得批次之間的可變性較高；（2)用于 最終產物加工的表面活性劑尾料（攜帶污染物）如雙（乙基己基）磺基琥珀酸鈉（也稱為 多庫酯鈉或（AOT))導致了毒性反應；（3)當將這些納米顆粒放置在生物介質中時，表面活 性劑尾料量的無法控制產生了聚集的問題，導致功效和可遞送性降低；以及（4)鈰（+3/+4) 的價態隨時間的不穩定性。因此，通過反膠束微乳化技術制備的鈰氧化物納米顆粒在批次 之間是高度可變的，并且對于哺乳動物細胞顯示出比期望毒性更高的毒性。
[0007] 作為替代方案，Rzigalinski等在WO 2007/002662中報道了通過高溫技術合成的 納米二氧化鈰的生物功效，其由至少三種商業來源獲得。據報道，鈰氧化物納米顆粒的這些 新來源提供了批次之間活性的優異可再現性。還報道了在不考慮來源的情況下，具有小尺 寸、窄尺寸分布和低聚集速率的鈰氧化物顆粒是最有利的。就尺寸而言，該公開內容具體地 斷定，在顆粒進入細胞內部的實施方案中，進入細胞的顆粒的優選尺寸范圍為約Ilnm至約 50nm，例如約20nm。在顆粒從細胞外側對細胞發揮其作用的實施方案中，這些胞外顆粒的優 選尺寸范圍為約Ilnm至約500nm〇
[0008] Rzigalinski等還報道對于遞送，納米顆粒的非聚集形式是有利的。為了實現該目 標，他們報道可在超高純水中或在用超高純水所制備的生理鹽水中對按重量計約10%的原 液進行超聲處理。然而，如其他人注意到的，通過高溫技術合成的納米二氧化鈰（例如獲得 自商業來源）的超聲處理水性分散體是高度不穩定的并且快速沉降（即，在幾分鐘內），造 成施用來源于這些來源之納米二氧化鈰的水性分散體時具有很大的可變性。
[0009] Rzigalinski等報道了在相對簡單的模型系統中的生物功效，包括體外細胞培養 物、經口喂養的黑腹果蠅，以及以明顯小于治療劑量（300納摩爾或約0. 2mg/kg)尾靜脈注 射的小鼠。
[0010] Yokel 等在 Nanotoxicology，2009, 3 (3) :234-248 中描述了對商業二氧化鋪納米 材料的生物分布和氧化應激作用進行的深入研宄。特別地，將得自于Aldrich的5%納米二 氧化鋪分散體（#639648)超聲處理3分鐘并以50mg/kg、250mg/kg和750mg/kg的納米二氧 化鈰劑量輸注到大鼠中。對該材料而言，任何納米顆粒表面穩定劑的性質都是未知的。納 米二氧化鈰顆粒的尺寸通過各種技術進行表征并且通過動態光散射報道為平均31+/-4nm。 透射電子顯微鏡法（transmission electron microscopy，TEM)表明大部分顆粒為具有雙 峰粒度分布（峰在8nm和24nm處）的片狀物，并且一些顆粒為~100nm。觀察到使血液與 該形式納米二氧化鈰一起孵育1小時具有范圍為~200nm至大于1微米的聚集物，并且當 輸注到大鼠中時，其從血液中被快速清除（半衰期為7. 5分鐘）。雖然觀察到大部分納米二 氧化鈰聚集在肝和脾中，但是尚不清楚任何顯著量穿過血腦屏障并進入腦組織細胞。
[0011] 然后，Yokel等試圖對納米二氧化鈰表面涂層（穩定劑）進行精確控制并通過 Masui等，J. Mater. Sci. Lett. 21，489-491 (2002)的直接兩步水熱制備法（其包括檸檬酸鈉 作為生物相容穩定劑）制備了納米二氧化鈰的穩定水性分散體。高分辨率TEM表明，該形 式的納米二氧化鈰具有邊緣尖銳的結晶多面體顆粒形態以及4nm至6nm的窄粒度分布。據 報道，在7. 35的生理pH和-53mV的G電勢下，這些平均尺寸為5nm的二氧化鈰納米顆粒 的檸檬酸鹽穩定化分散體在大于2個月中是穩定的。因此在施用前不需要進行超聲處理。
[0012] Hardas 等，Toxicological Sciences 116 (2)，562-576 (2010)報道了該形式的朽1 檬酸鹽穩定化納米二氧化鈰的廣泛生物分布和毒理學研宄的結果。出乎意料地，他們報道 與先前研宄的~30nm納米二氧化鋪（Aldrich(#639648)，以上所述）相比，這種更小的納米 二氧化鈰毒性更大，在腦中未觀察到，并且對海馬和小腦中的氧化應激產生很小的影響。這 些結果與"設計得更小的納米材料將易于穿過血腦屏障的假設"相違背。
[0013] 雖然包含鈰氧化物的納米顆粒可通過本領域已知的各種技術來制備，但是所述顆 粒通常需要穩定劑以防止不期望的聚集。關于先前所用的生物相容納米二氧化鈰穩定劑， Masui等，J. Mater. Sci. Lett. 21,489-491(2002)描述了直接產生二氧化鈰納米顆粒的穩 定水性分散體的兩步水熱方法，其使用檸檬酸鹽緩沖劑作為穩定劑。然而，該方法既耗時又 設備密集，其需要在大的密封反應器中進行兩個單獨的24小時反應步驟。
[0014] Sandford等，WO2008/002323A2報道了使用生物相容穩定劑（乙酸）的水性制備 技術，其直接產生二氧化鈰的納米顆粒分散體而無需進行沉淀或分離步驟，并且不需要后 續的煅燒。三價鈰離子被硝酸根離子緩慢氧化為四價鈰離子，并且在將乙酸用作穩定劑時 獲得了Ilnm微晶尺寸（約等于晶粒尺寸）的穩定的非聚集溶膠。
[0015] DiFrancesco 等在于 2007 年 9 月 4 日提交的 PCT/US2007/077545, METHOD OF PREPARING CERIUM DIOXIDE NANOPARTICLES中描述了，在生物相容穩定劑（例如檸檬酸、乳 酸、酒石酸、乙二胺四乙酸（EDTA)及其組合）的存在下，在低pH(< 4. 5)下三價鈰離子被 過氧化氫氧化。具體地，穩定劑乳酸和乳酸與EDTA的組合均示出直接產生了納米二氧化鈰 的穩定分散體（平均粒徑為3nm至8nm)而無需進行中間顆粒分離步驟。
[0016] Karakoti等在J. Phys. Chem. C111，17232-17240(2007)中報道了通過在酸性條 件（過氧化氫）和堿性條件（氫氧化銨）兩者中氧化三價鈰離子在單糖/多糖中直接合成 了納米二氧化鈰。所公開的具體生物相容穩定劑包括葡萄糖和葡聚糖。雖然公開了小至 3nm至5nm的單一粒徑，但是產生了 IOnm至30nm的弱聚集體。雖然沒有描述膠體不穩定性 的起因，但是認為這些顆粒的G電勢大小可能不夠大。
[0017] Karakoti 等在 JOM (Journal of the Minerals，Metals&Materials Society) 60 (3)，33-37 (2008)中評論了在生物相關介質（使得與生物體生理相容）中合成 納米二氧化鈰的穩定分散體的挑戰，諸如需要理解膠體化學電位、粒徑、分散劑、溶液 PH等）使得不干擾能夠清除自由基（活性氧類（ROS)和活性氮類）的納米二氧化鈰的還原 /氧化（redox)能力。Karakoti等具體描述了在不存在任意穩定劑時以及在存在葡聚糖、 乙二醇和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)穩定劑時，在低pH(< 3. 5)下硝酸鋪被過 氧化氫氧化。雖然報道了粒徑為3nm至5nm，但是還報道了顆粒聚集至IOnm至20nm。
[0018] Kim等在Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51，1-6中報道了通過反膠束方法合成并用磷 脂-聚乙二醇（PEG)包封的3nm納米二氧化鈰可通過減小腦梗死體積并通過清除ROS來預