一種增強體外培養間充質干細胞生物抗氧化功能的細胞外基質生物材料、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學領域，尤其涉及一種增強體外培養間充質干細胞生物抗氧化功能的細胞外基質生物材料、制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種負責組織再生和修復的成體干細胞，最初發現于骨髓中，由于其再生和免疫調節的潛能，已在各大領域引起廣泛的關注。人類臍帶間充質干細胞，尤其是來源于Wharton’s jelly (臍帶中包繞兩條臍動脈和一條臍靜脈黏蛋白樣結締組織)被認為是細胞治療和再生醫學中理想的種子細胞。臍帶是一種胚胎外組織，因此臍帶間充質干細胞具備胚胎干細胞和成體干細胞的雙重特性，其自我更新及多向分化潛能明顯優于骨髓間充質干細胞。
[0003]有越來越多的證據表明，活性氧(ROS)對細胞增殖、分化、死亡、基質環境的穩態、氧化還原信號機制等是必不可少的，但細胞異常水平的ROS會導致DNA、蛋白質、脂類不可逆轉的損害，最終細胞走向衰老和死亡的命運。
[0004]盡管MSCs在再生醫學中的應用得到廣泛關注，但其在體外擴增和體內移植過程中卻不可避免的暴露于相當大的氧化應激之下，造成ROS (如過氧化氫、羥基自由基、超氧化物陰離子自由基)超標。體外長期培養的MSCs內H2O2水平增加，導致細胞衰老和增殖抑制。骨性關節炎和類風濕關節炎患者體內軟骨細胞或中性粒細胞和巨噬細胞產生異常水平的ROS，影響MSCs的再生潛力。研宄表明，ROS的累積是由于接觸炎癥細胞因子引起，從而抑制干細胞的細胞增殖和多向分化潛能。
[0005]ROS生成和消除之間的平衡對細胞生存、增殖、分化至關重要。超氧化物歧化酶(SOD)，包括含有銅、鋅(S0D1和S0D2)和錳(S0D2)的同功酶，保護MSCs免受超氧化物陰離子催化生成的H2O2的活性氧損害。氧化應激可以消除S0D2引起的人類滑膜起源的間充質干細胞的軟骨分化能力下降和基質金屬蛋白酶的表達增加。此外，SOD產生的H2O2被過氧化氫酶(catalase)所中和，先前的大量研宄表明，提高MSCs內的catalase活性有利于緩解H2O2誘導的細胞凋亡。
[0006]MSC起源的細胞外基質(ECM)組分包含I型和III型膠原蛋白，纖連蛋白、層粘連蛋白，可以充當體外培養系統的微環境，促進MSC擴增、指引MSC向特定方向分化。脫細胞的ECM不僅可以模擬體內干細胞細胞外微環境，還可調節生長因子和激素的生物學行為。這種運用脫細胞的ECM的培養方法可防止細胞復制衰老，增強終末分化細胞的再分化能力，如軟骨細胞和髓核細胞。最近的研宄表明，脫細胞的ECM能改善骨髓間充質干細胞抵抗H2O2誘導的氧化應激和細胞周期停滯。然而，ECM對臍帶間充質干細胞內抗氧化系統的影響卻鮮有人知。
【發明內容】
[0007]解決的技術問題:針對現有的MSCs在體外擴增和體內移植過程中不可避免的暴露于相當大的氧化應激之下，造成ROS超標的缺點，本發明提供一種增強體外培養間充質干細胞生物抗氧化功能的細胞外基質生物材料、制備方法及其應用，通過臍帶間充質干細胞分泌基質制備細胞外基質生物材料，不僅具有多種蛋白質成分的特征，而且能用于間充質干細胞的體外擴增，具有生物相容性好、增殖效率高、顯著降低細胞內活性氧含量的優點。
[0008]技術方案:
本發明的檢測內容包括:(I)細胞外基質生物材料對UC-MSCs增殖能力的影響；(2)細胞外基質生物材料對UC-MSCs內ROS和H2O2表達的影響；(3)細胞外基質生物材料對UC-MSCs內S0D-2表達的影響；(4)細胞外基質生物材料對UC-MSCs內Catalase活性的影響。
[0009]上述所述的內容通過以下步驟實現:
(A)臍帶間充質干細胞(umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)培養在完全培養基中(完全培養基組分為a-MEM和胎牛血清，它們的體積比為(4-9): 1，并且含有抗生素，抗生素的含量為10~200 U/mL)，密度多90%時，加入含有抗壞血酸(100-200uM)的完全培養液培養7-10天，每3天換液一次，之后加入脫細胞液(由pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有Triton X-100 0.5-5%體積比和氨水10_40mM)，構建成細胞外基質生物材料；
(B)UC-MSCs分別培養在普通的孔板(TCPS板)和底部鋪有細胞外基質生物材料的孔板(ECM板)中，在不同的時間點檢測孔板中DNA含量，二乙酸熒光素(FDA)染色記錄不同時間點的細胞數量及形態變化；
(C)檢測TCPS板和ECM板上UC-MSCs內ROS和H2O2含量；
(D)檢測TCPS板和ECM板上UC-MSCs內S0D-2含量和Catalase活性。
[0010]所述UC-MSCs取自人源、豬源、鼠源或兔源。
[0011]所述細胞外基質生物材料可應用于包括細胞移植治療和再生醫學等領域。
[0012]上述所述的內容具體分析步驟如下:
(I)FDA染色、DNA定量檢測分析細胞外基質生物材料對UC-MSCs增殖能力的影響。
[0013](2) DCF-DA熒光定量法檢測細胞內ROS水平。
[0014](3) H2O2檢測試劑盒檢測細胞內H 202水平。
[0015](4) Western bort 檢測細胞內 S0D-2 含量。
[0016](5) Catalase活性檢測試劑盒檢測細胞內Catalase活性水平。
[0017]H2O2是ROS主要成分之一，在細胞增殖中起著雙重作用。低水平的H2O2 (〈10 μΜ)刺激成纖維細胞生長，而細胞暴露于高濃度的H2O2 (>400 μ Μ)則會快速凋亡。本發明的方案表明，細胞外基質生物材料培養細胞的細胞內H2O2水平下降，是支持細胞體外生存和快速增殖的一個重要原因。此外，超氧化物陰離子以劑量依賴的方式影響細胞增殖，低水平的超氧化物陰離子刺激細胞增殖，濃度增加則會抑制細胞生長。
[0018]增強抗氧化能力引起UC-MSCs中ROS水平下降，臨床治療方面有著廣泛的應用。骨性關節炎中軟骨細胞的S0D-2活性受損不僅導致其氧化損傷，還能加快骨性關節炎的發病進程。
[0019]MSCs廣泛應用于細胞移植治療和組織工程的研發，然而病理條件下超標的ROS產生的炎癥細胞因子改變了 MSCs的某些特性，影響其生存。因此在體內移植的過程中，防止細胞氧化應激損傷和提高細胞存活率顯得尤為重要。先前的研宄證明細胞培養在源自滑膜細胞或骨髓細胞的脫細胞ECM顯著降低ROS水平，這樣闡明ECM調控細胞內抗氧化防御的潛在分子機制將變得很有意義。
[0020]有益效果:本發明提供的一種增強體外培養間充質干細胞生物抗氧化功能的細胞外基質生物材料、制備方法及其應用，MSCs在該細胞外基質生物材料中培養比在TCPS板上培養的細胞內抗氧化活性的酶表達水平更高，尤其是S0D-2和Catalase ;S0D_2和Catalase活性增強導致ROS和H2O2水平減少，因此細胞外基質生物材料能夠增強體外培養間充質干細胞生物抗氧化功能。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1為FDA染色記錄不同時間點TCPS板和ECM板上UC-MSCs的增殖情況圖。
[0022]圖2為DNA定量檢測分析不同時間點TCPS板和ECM板上UC-MSCs的增殖情況圖。
[0023]圖3為TCPS板和ECM板上UC-MSCs內ROS和H2O2含量變化圖。
[0024]圖4為TCPS板和ECM板上UC-MSCs內S0D-2含量變化圖。
[0025]圖5為TCPS板和ECM板上UC-MSCs內Catalase活性變化圖。
[0026]
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例對本發明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。
[0028]實施例1
具體實驗步驟如下: