一種蠶絲人工血管及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學工程領域，具體涉及一種蠶絲人工血管及制備方法。
【背景技術】
[0002]在冠狀動脈搭橋術、血管替代術、血管內瘺等外科手術中需要大量的血管移植體。自體血管是最佳選擇，在自體血管的移植中，會對供區導致一定的損害，于是人們采用同種異體血管如帶網人體臍靜脈等和異種血管如小牛的頸內靜脈和胸主動脈等作為血管移植體。同種異體血管來源有限并具有一定的免疫原性，須經戊二醛處理，以使抗原性減弱。異種血管雖然來源較豐富，但是也具有一定的免疫原性，也須經戊二醛處理才能供臨床使用。經戊二醛進行處理后的血管無生物活性，相當于一種管狀的細胞外基質。鑒于以上原因，人們致力于進行人工血管的研宄。
[0003]人工血管又稱人造血管。廣義的人工血管應該是指除自體血管以外的其他血管移植體。在通常情況下，人工血管是指組織工程血管。文獻報道及國家食品藥品監督管理總局數據顯不，目前國內應用于臨床的人工血管主要有Hemothes，FlowLine B1pore,GORE-TEX，VascuGraft SOFT，VascuGraft PTFE等。這些產品幾乎全部具有國外知識產權，因此，研制具有我國自主知識產權并能應用于臨床的人工血管產品宄甚為必要。
[0004]許多材料被應用于人工血管的研制中，如甲殼素、膠原蛋白、絲素蛋白、葡聚糖、明膠、細菌纖維素、聚羥基丁酸酯、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、脫細胞基質材等。PETER A.JONES(1979)甚至用體外復合培養的血管內皮細胞和平滑肌細胞所形成的膜狀物作為人工血管。蠶絲是由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等十八種氨基酸所組成的天然蛋白質，是一種由家蠶分泌的天然纖維狀高聚物，主要由重復的Gly-Ala-Gly-Ala-Ser多肽單元所組成。蠶絲的結構特性決定了它所具有的生物活性，組成絲素的主要氨基酸對人體有特殊的作用功能。蠶絲是指蠶繭絲又稱桑蠶繭絲，與蜘蛛絲和柞蠶絲在直徑、成分、內部結構等方面均有顯著區別。在通常情況下，蠶絲是由兩根單絲(由絲素蛋白構成)平行粘合而成，四周由絲膠(由絲膠蛋白構成)包覆。單絲的橫截面形狀以三角形和橢圓形為主，平均橫截面面積為100平方微米左右。絲素蛋白和絲膠蛋白是兩種不同的物質，天然蠶絲由絲素蛋白和絲膠蛋白組成。在蠶絲的生產過程(繅絲)中，部分絲膠蛋白會溶解于熱水中，即繅絲后所得到的蠶絲(熟絲)仍然由絲素蛋白和絲膠蛋白組成。蠶絲經完全“脫膠”處理后，絲膠被完全去除，余下2條單絲，每條單絲內部會出現眾多寬度為2 μπι左右的縫隙。
[0005]人工血管的降解性質是一個相對的概念，因此，可大致將其分為可降解型和不可降解型人工血管。目前在臨床上使用最為普遍的膨體聚四氟乙烯(ePTFE)屬于不可降解型，由絲素蛋白等可降解材料所制備的人工血管屬于可降解型。汪忠鎬等(2008)認為:“應用可降解支架去制就長期耐壓、具有舒縮功能的組織工程血管，在概念上就是矛盾的”。因此，采用不可降解或降解較為緩慢的材料制備人工血管似乎更適合臨床的要求。而應用蠶絲制備人工血管存在兩個問題:(I)蠶絲由絲素蛋白和絲膠蛋白構成，在體外與體內可緩慢降解。(2)絲素蛋白和絲膠蛋白均具有較強的免疫原性，其免疫原性動員細胞吞噬的結果是其降解的根本原因。
[0006]另外，汪忠鎬等認為，滿足臨床要求的人工血管必須具有以下條件即:(1)抗張裂強度與隱靜脈相當，即>1700mm Hg[ (1680±307)mmHg] ； (2)有抗疲勞能力，即體外搏動負荷測試30天后直徑不變，或變化與同種異體移植物相似；(3)具有完整內皮層。由血管內皮細胞構成的完整的內表面是血管必須的結構，血管內皮細胞沿著血流方向進行排列，是將血液和血管組織進行隔離的重要結構，擔負防止血液凝固、維持血液正常流動以及保障血管健康的至關重要的結構。未經內皮預襯的人工血管，在移植初期由于導致凝血作用導致血栓形成并最終導致管腔閉塞，是臨床上的常見病例。周靜然等(2015)統計該單位在2010年4月至2014年7月間行下肢人工血管植入術的20例患者，其中5例管腔通暢，9例輕度狹窄，3例中重度狹窄，3例閉塞。Erman Pektok等(2008)報道了聚己內酯(PCL)和膨體聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管在大鼠腹主動脈移植后的形態變化。內皮不完整，厚度不一致，內管腔面不平整是這兩種人工血管的顯著特征。這種情況基本體現了目前人工血管在臨床使用中所面臨的普遍問題。目前，現有的人工血管均無法達到具有完整內皮層的要求。
[0007]因蠶絲具有的生物活性，組成絲素的主要氨基酸對人體有特殊的作用功能，蠶絲是理想的人工血管材料，如何發揮蠶絲人工血管的優點，并克服其不足之處，成為科研工作者、醫生和器械生產廠商的必須解決的問題。
【發明內容】
[0008]本申請發明人通過長期的研宄發現，以蠶絲為材料編織血管本體，然后將絲膠蛋白糖基化后與蠶絲復合，再用醛對絲膠蛋白進行交聯以降低其水溶性，可以解決上述的降解的問題；同時，糖基化并交聯的絲膠蛋白填充血管本體蠶絲纖維間的縫隙以防止血液滲漏，并提高血管的剛性，且由于糖基化的絲膠蛋白位于人工血管的表面，能降低其免疫原性和提高抗凝血作用，并使其難以降解。本發明正是基于上述發現而得以完成的。
[0009]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種人工血管，該人工血管免疫原性低，抗凝血作用強，且難以降解，植物移植顯示，該人工血管在I年的時間中，其遠期通暢率為80%以上；本發明的目的之二在于提供所述人工血管的制備方法，該方法簡單可行；本發明的目的之三是提供了糖基化的絲膠蛋白與蠶絲復合在制備人工血管中的應用，目前未見有同時以絲膠蛋白和熟絲為材料制備人工血管的報道。
[0010]為實現上述目的，本發明的技術方案為:
[0011]人工血管，所述人工血管包括以蠶絲編織成的血管本體和填充在血管本體纖維縫隙的糖基化并進行交聯的絲膠蛋白。
[0012]本申請的發明人分別將絲膠蛋白、絲素蛋白、生絲和熟絲(即經繅絲處理)，埋置于大鼠皮下，實驗結果顯示，它們間的免疫原性無顯著差異。通過4個月體外降解實驗，發現生絲和經脫絲膠處理的生絲的降解率(W/W)為分別為12.5%和12.9%。經6個月的大鼠皮下埋植，統計殘存的單絲數量與埋植的單絲總量相比，發現生絲和經脫絲膠處理的生絲的降解率分別為34.1%和33.5%。并且還發現蠶絲在體內的降解與組織液和酶的關系不是很大，但是，細胞的吞噬作用是其降解的根本原因。
[0013]對人工血管進行糖基化可降低其免疫原性，絲素蛋白和絲膠蛋白易于被糖基化。
[0014]進一步，所述的人工血管，所述蠶絲為蠶絲經繅絲后所得到的熟絲。絲素蛋白和絲膠蛋白是兩種不同的物質，天然蠶絲由絲素蛋白和絲膠蛋白組成。在蠶絲的生產過程(繅絲)中，部分絲膠蛋白會溶解于熱水中，即繅絲后所得到的蠶絲(熟絲)仍然由絲素蛋白和絲膠蛋白組成。即絲素蛋白，絲膠蛋白和熟絲是在化學成分和物理性質方面完全不同的物質。
[0015]本發明的人工血管的制備方法，包括如下進行的步驟:
[0016](I)血管本體的制備
[0017]用蠶絲編織成管狀物，得血管本體；
[0018](2)血管本體與糖基化絲膠蛋白的復合
[0019]取糖基化的絲膠蛋白，制備濃度為1-10% (W/V)糖基化絲膠蛋白水溶液備用；將步驟(I)所得的血管本體進行熱處理定型后浸泡于所得的糖基化絲膠蛋白水溶液中l-8h，取出，30-50°C烘干，重復浸泡-烘干的步驟1-3次，制備出血管I ;
[0020](3)表面改性
[0021]將步驟⑵所得的血管I浸泡于濃度為1-5% (V/V)的戊二醛溶液2_12h，取出30-50°C烘干，然后在濃度為1-10% (W/V)糖基化絲膠蛋白水溶液中浸泡2-12h，取出30-50°C烘干，再浸泡于濃度為1-5% (V/V)的戊二醛溶液2-12h，取出30_50°C烘干，重復戊二醛溶液浸泡-糖基化絲膠蛋白水溶液浸泡-戊二醛溶液浸泡1-3次后，在三蒸水中漂洗1-3次，每次10-12h，冷凍干燥即為血管II ；
[0022](4)內皮預襯
[0023]將步驟(3)所得的血管II進行內皮化預襯即得人工血管。
[0024]上述的制備方法，所述步驟(I)中的蠶絲優選為熟絲。
[0025]上述的制備方法，所述步驟(I)中，所述的血管本體優選為內徑為2_20mm，長度為50-500mmo
[0026]糖基化作用與動物體內的自生免疫響應直接相關，是一個內涵很豐富而且比較復雜的問題。對于本研宄而言，可以簡單地認為，經糖基化的蛋白質可以“躲過”免疫系統和蛋白酶的識別而在體內保持結構的穩定。糖基化作用的應用實例很多，如對室溫保存的血液進行糖基化作用可以防止血小板的聚集從而起到抗凝作用，通過糖基化去除大豆球蛋白免疫原性等。目前國內外尚無對人工血管進行糖基化的報道，也無對絲素蛋白或絲膠蛋白進行糖基化的報道。
[0027]通常采用聚糖對蛋白質進行糖基化。糖基化的方式比較多，如O位糖基化，即以蘇氨酸或絲氨酸殘基上的氧連接聚糖以修飾蛋白質。N位糖基化，即以天冬酰胺側鏈的酰胺氮與聚糖連接從而對蛋白質進行修飾。在絲素蛋白質中，天冬氨酸和絲氨酸的質量百分比分別為2.63%和12.29% ο在絲膠蛋白中，絲氨酸和天冬氨酸的質量百分比分別為33.43%和
16.71 %。由此可見，上述兩種糖基化方式都適合于絲素蛋白質和絲膠蛋白。
[0028]上述的制備方法，所述步驟(2)中，優選的，所述糖基化的絲膠蛋白是采用聚糖對絲膠蛋白進行糖基化。
[0029]進一步，所述聚糖對絲膠蛋白進行糖基化的方法為:取濃度為1-lOg/lOOmL的絲膠蛋白水溶液，調節pH為11 ±0.5，30-70°C攪拌30_120min，室溫冷卻后加入聚糖，調節pH為10-12，攪拌30-120min，冷凍干燥得絲膠蛋白與聚糖混合物凍干粉，將混合物凍干粉于45-70 0C，相對濕度為50-80 %，反應12_120h，即得糖基化的絲膠蛋白。
[0030]可對所獲得的糖基化的絲膠蛋白進行糖基化效果(接枝度)分析，具體為:分別取一定量的絲膠蛋白和上述糖基化絲膠蛋白，以0.lg/100mL的SDS溶液為溶劑，配制成
0.2g/100mL 的蛋白溶液，取 0.4mL 蛋白溶液，加 2mL PBS (pH = 8.2)，ImL 0.1g/1OOmL TNBS試劑，震蕩混勻后，在50°C水浴中遮光反應lh，加2mL 0.1摩爾/升的鹽酸終止反應，室溫靜置30min，以三蒸水為空白，在波長為420nm處測定吸光度。用賴氨酸制作標準曲線，分別測定絲膠蛋白和上述經糖基化的絲膠蛋白中自由氨基的含量CjP C2，按以下公式這算接枝度。
[0031]接枝度(％)= [(C廠 C2)/C1] XlOO
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