孔壁半石墨化介孔硅納米粒及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發明屬制藥領域，涉及化療-光熱聯合治療載體，具體涉及孔壁半石墨化介孔硅納米粒及其制備方法和在制備聯合治療腦膠質瘤藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]腫瘤聯合治療已成為腫瘤治療的熱點，特別是可控性的化療和近紅外光介導的光熱治療的聯合，因其在克服腫瘤多藥耐藥、提高腫瘤治療效果、減少對正常組織的損傷方面具有獨特的優勢，目前備受本領域技術人員的關注。
[0003]化療-光熱聯合治療腫瘤成功與否的關鍵在于所使用的載體材料。理想的化療-光熱聯合治療載體，既要求具有足夠高的近紅外吸收光熱轉換能力，以利于光熱治療，又要求具有足夠強的載藥能力，以利于化療，同時要求本身分散性好，生物相容。已有文獻報道，具有局域表面等離子體共振的貴金屬納米材料如金納米粒、鈕納米片、銀納米粒等，以及具有近紅外吸收的碳納米材料如碳納米管、石墨烯等，可以作為化療-光熱聯合治療的載體。然而，為了使貴金屬材料在能穿透深層組織的近紅外光窗口有強的吸收，使碳材料具有良好的親水性，以及使材料具有大的比表面積以利于藥物裝載，通常需要對這些材料進行復雜的修飾，其耗時長，成本高。并且，大多數用于化療-光熱聯合治療的納米平臺，產熱點集中在納米載體中心，減弱光熱效果，降低近紅外觸發的藥物釋放，不利于腫瘤治療。
[0004]介孔硅納米粒MSN是目前廣泛研究的藥物載體，因其具有高的表面積、大的孔體積、可調的孔徑和較好的親水性。MSN表面富含硅醇基，可方便地連接功能基團，達到可控藥物遞釋。然而，現有技術的MSN制備過程需要使用有毒的模板劑，即使經過費時費力的去除過程，仍會有模板劑殘留，不利于生物應用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為克服現有技術存在的缺陷，提供孔壁半石墨化介孔硅納米粒及其制備方法，尤其是在將介孔硅納米粒制備過程中的有毒模板劑半石墨化，合成孔壁半石墨化的介孔娃納米粒。
[0006]本發明中，使用簡便的方法使MSN制備過程中的有毒模板劑變成半石墨化的碳，均勻分布于介孔硅內壁，制成孔壁半石墨化的介孔硅納米粒TsGMSN。制得的TsGMSN保留了 MSN的優良性能，免除了殘留模板劑的毒性，同時賦予其新的功能如可控釋放、化療-光熱聯合治療特性。
[0007]本發明的進一步目的是將制得的孔壁半石墨化的介孔硅納米粒載藥后用于制備化療-光熱聯合治療腦膠質瘤的藥物。
[0008]本發明基于腦膠質瘤通過手術切除、放療、化療等，難以達到良好的治療效果現狀，以制得的TsGMSN為載體，負載抗腫瘤藥物阿霉素D0X，利用該載體的優良特性，實現腦膠質瘤的化療-光熱聯合治療。
[0009]本發明中，通過下述步驟合成孔壁半石墨化介孔娃納米粒:
[0010]一定量的CTAB水溶液加熱至80°C，加入適量NaOH溶液后劇烈攪拌，隨后加入適量TEOS攪拌2h，離心獲得固體產物，水洗除去納米粒表面吸附的表面活性劑，過濾，凍干；所得固體產物浸入98%濃硫酸溶液數小時，干燥，惰性氣體條件下高溫灼燒一定時間，制得孔壁半石墨化的介孔硅納米粒TsGMSN。
[0011]上述合成方法中，CTAB:TEOS: NaOH: H2O 的質量比為 1:4.7:0.28:480。
[0012]上述合成方法中，通過向CTAB堿溶液中加入1，3，5-TMB調節TsGMSN介孔孔徑和孔壁半石墨化碳含量，I, 3，5-TMB和CTAB的質量比為O?1.2:1。
[0013]上述合成方法中，凍干后固體產物:98%濃硫酸:H20的質量比為:1:0.08?0.36:1 ?4。
[0014]上述合成方法中,惰性氣體為氮氣、氬氣和氦氣。
[0015]上述合成方法中，惰性氣體條件下高溫灼燒的條件為:450°C<溫度彡1000°C，0.5h彡時間彡10h。
[0016]本發明通過物理表征方法，性質表征方法對所制備的TsGMSN進行表征，其中，
[0017]物理表征方法包括:掃描電鏡、透射電鏡、小角X射線衍射、N2吸附脫附等溫線、拉曼光譜和熱重曲線；
[0018]性質表征方法包括:紫外-可見吸收光譜和熱效應測試。
[0019]本發明所制備的孔壁半石墨化介孔硅納米粒(TsGMSN)，其顆粒形狀為球形，顆粒尺寸為115±20nm，具有高度有序的六方P6mm介孔結構，晶胞參數為3.73nm,孔徑1.5?3.0nm可調，半石墨化碳含量5%?13%可調，比表面積和孔體積分別約為769111?4和0.TScm3g-1 ;在808nm處有強的近紅外吸收，其光熱轉換顯示出濃度依耐性和激光能量強度依賴性，濃度為50 μ g/ml的TsGMSN溶液在能量強度為6W/cm2的近紅外激光照射5分鐘后，溫度可達到53 °C。
[0020]本發明進一步制備載DOX的孔壁半石墨化介孔硅納米粒(TsGMSND)遞藥系統:
[0021]一定量TsGMSN分散于適量pH值為9.0的磷酸鹽緩沖液PBS中，加入等體積適當濃度的DOX水溶液，調節最終溶液pH值為9.0，避光攪拌一定時間，離心獲得固體產物，使用pH值8.0的PBS溶液潤洗去除表面吸附的D0X，即得TsGMSND。
[0022]固體產物分散于pH值為7.4的PBS溶液，配成適當濃度使用。
[0023]上述制備方法中，合成投料質量比為:1TsGMSN: 1.8?3.6D0X。
[0024]上述制備方法中，避光攪拌反應時間為24h?72h。
[0025]本發明測試TsGMSND在不同pH條件下的熱觸發累積釋放情況。TsGMSND分別均勻分散于pH為5.0、6.0和7.4的PBS溶液中，置于MWCO為8_10kDa的透析管中，在設定的時間點，取液測試，并補足同等體積的相應溶劑，近紅外照射組使用能量強度為6W/cm2的近紅外激光照射5分鐘，釋放的DOX采用熒光光譜儀測定，結果顯示，TsGMSND的釋放是熱觸發和pH響應的，并且具有緩釋特性。
[0026]本發明進一步評價所制備的TsGMSND納米遞藥系統化療-光熱聯合治療腦膠質瘤的效果。
[0027]本發明使用激光共聚焦顯微鏡觀察不同處理后人腦膠質瘤細胞U251的死亡情況:TsGMSN和TsGMSND分別與腦膠質瘤U251細胞避光孵育2h，濃度為20 μ g/ml,50 μ g/ml和100 μ g/ml(以TsGMSN的質量計算)，光熱治療組使用近紅外激光照射5分鐘，能量強度為6ff/cm2,更換新鮮培養液，繼續孵育12h，按照Live-Dead試劑染色說明進行細胞染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，活細胞呈綠色，死細胞呈紅色；結果顯示，在不同濃度時，化療和光熱治療聯合治療組(TsGMSND+NIR組)的腫瘤細胞死亡明顯高于單純的化療組(TsGMSND組)或單純的光熱治療組(TsGMSN+NIR組)，提示聯合治療的良好效果，結果還顯示，單純TsGMSN未經任何處理組沒有觀察到明顯細胞毒性。
[0028]本發明使用CCK-8檢測法定量考察不同處理方法對人腦膠質瘤細胞U251的毒性:
[0029]制備TsGMSN和TsGMSND成系列濃度，與U251細胞避光孵育4h，光熱治療組使用近紅外激光照射5分鐘，能量強度為6W/cm2，更換新鮮培養液，繼續孵育12h，按照CCK-8使用說明定量檢測細胞毒性，未經任何處理的U251細胞作為對照，結果顯示半數抑制濃度IC5tl值分別為:單純TsGMSN未經任何處理組(4.131θ+09μ g/ml，以TsGMSN質量計算)、單純的化療組(468.45μ g/ml,以DOX質量計算)、單純的光熱治療組(74.83μ g/ml,以TsGMSN質量計算)以及化療和光熱治療聯合治療組(90.97 μ g/ml,以DOX質量計算，和24.72 μ g/ml,以TsGMSN質量計算)，由此計算得到聯合指數值Cl為0.589，該值小于1，表明化療和光熱治療具有協同作用。
[0030]本發明提供了一種經濟實用的孔壁半石墨化介孔硅納米粒的制備技術及其應用方法。
[0031]本發明的突出優點在于，提供一種簡便的方法，將介孔硅納米粒制備過程中的有毒模板劑半石墨化，合成孔壁半石墨化的介孔硅納米粒，載藥后用于化療-光熱聯合治療腦膠質瘤，結果顯示具有協同作用。本發明所合成的TsGMSN，與現有的介孔硅納米粒MSN相t匕，保留了 MSN的優良性能，巧妙地避免了殘留模板劑的毒性；制備成TsGMSND納米遞藥系統，具有優異的功能，如熱觸發釋放藥物性能、PH敏感釋放藥物性能、近紅外激發產熱性能、化療-光熱治療特性等。
【附圖說明】
[0032]圖1TsGMSN的物理表征結果，
[0033]其中，A:掃描電鏡圖(插入圖:相應的透射電鏡和粒徑分布曲線)，
[0034]B:透射電鏡圖(插入圖:單個粒子的透射電鏡圖)，
[0035]C:小角X射線衍射圖(插入圖:高分辨率透射電鏡圖)，
[0036]D =N2吸附脫附等溫線(插入圖:孔徑分布曲線)，
[0037]E:拉曼光譜圖，
[0038]F:熱重曲線。
[0039]圖2載體材料的性質表征結果，
[0040]其中，A:不同載體材料的紫外-可見吸收光譜曲線，
[0041]B:固定濃度為50μ g/ml，能量強度為6W/cm2，不同載體材料的熱效應曲線，
[0042]C:固定能量強度為6W/cm2，不同濃度TsGMSN的熱效應曲線。
[0043]圖3TsGMSND在不同pH條件下的熱觸發累積釋放曲線，近紅外照射組固定能量強度為 6W/cm2。
[0044]圖4共聚焦顯微鏡觀察U251細胞經不同處理后的死亡情況
[0045]其中，近紅外照射組固定近紅外能量強度為6W/cm2，綠色表示活細胞，紅色表示死細胞，Bar=75 μ m
[0046]A-H:濃度為 20 μ g/ml
[0047]1-P:濃度為 50 μ g/ml
[0048]Q-X:濃度為 100 μ g/ml。
[0049]圖5CCK-8法定量測定不同處理對U251細胞的毒性結果。
【具體實施方式】
[0050]實施例1.[0051 ] 稱量CTABlOOmg，溶于48ml水中，溶液加熱至80 °C，加入2M的NaOH溶液0.35ml后劇烈攪拌，隨后加入500 μ 1TE0S攪拌2h，使得CTAB:TE0S:Na0H:H2O的質量比為1:4.7:0.28:480，離心獲得固體產物，水洗除去納米粒表面吸附的表面活性劑，過濾，凍干。所得固體產物浸入98%濃硫酸溶液12h，使得固體產物:98%濃硫酸=H2O的質量比為1:0.12:2，干燥，氮氣條件下550°C灼燒5h，即得孔壁半石墨化的介孔硅納米粒TsGMSN。測得TsGMSN孔徑為1.5nm,孔壁半石墨化碳含量為5.5%。
[0052]實施例2.
[0053]稱量CTABlOOmg，量取 I, 3，5-TMB34 μ I (與 CTAB 的質量比為 0.3:1)，溶于 48ml 水中，溶液加熱至80°C，加入2M的NaOH溶液0.35ml后劇烈攪拌，隨后加入500 μ 1TE0S攪拌2h，使得CTAB: TEOS: NaOH: H2O的質量比為1:4.7:0.28:480，離心獲得固體產物，水洗除去納米粒表面吸附的模板劑，過濾，凍干。所得固體產物浸入98%濃硫酸溶液12h，使得固體產物:98%濃硫酸=H2O的質量比為:1:0.12:2，干燥，氮氣條件下550°C灼燒5h，即得TsGMSN。測得TsGMSN孔徑為1.9nm,孔壁半石墨化碳含量為7.2%。
[0054]實施例3.
[0055]稱量CTABlOOmg，量