Tgev、pedv二聯活疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品領域，具體涉及豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病 毒二聯活疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 豬傳染性胃腸炎（porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是引起豬腹 瀉的一種重要接觸性病毒性腸道傳染病，發病快，對2周齡以內仔豬有高度致死率，幾乎能 達到100%。5周齡以上的豬病死率較低，但是由于腹瀉的影響，生長慢，飼料報酬低，造成嚴 重的經濟損失。該病1946年由Doyle等人確定了病原。從60年代末起，我國許多省市有 該病流行。
[0003] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhoea, PED)是引起豬腹瀉的一種高度急 性、接觸性病毒性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為特征。該病最早于上世 紀70年代發生在英國和比利時，1973年先后在我國上海、遼寧、吉林等地分離到PEDV。PEDV 可在豬群中持續存在，各種年齡豬均易感。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發病率可達100%， 尤以哺乳仔豬嚴重，病死率達100%。目前，還沒有特效藥物抵抗豬流行性腹瀉病毒，由于該 病發病急，流行快，豬群一旦感染，就會給養殖戶帶來巨大的經濟損失。
[0004] 豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒均屬冠狀病毒科成員，二者引起的臨床 癥狀疾病的流行特點均及其相似，但是卻沒有免疫學和血清學相互交叉反應。豬群可單一 或混合感染這兩種病毒。為防控豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉，國內外專家做了很多研 究，但目前仍無特效藥物。
[0005] 免疫接種是防制該病的重要手段，國內外有使用疫苗的報道，但是效果不盡人意。 尤其近幾年，原來的疫苗對豬腹瀉病的保護越來越差，臨床上不斷出現腹瀉病例，這除了加 強飼養管理外，盡快研制出一種能夠有效防制豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉的疫苗已成 當務之急。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述問題，本發明提供由本發明人自行分離、致弱、保存的一株豬傳染性 胃腸炎病毒弱毒HB08株和一株豬流行性腹瀉病毒弱毒ZJ08株，利用兩毒株制備一種豬傳 染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯活疫苗，用于防制目前流行的豬傳染性胃腸炎和豬流行性 腹瀉兩種疾病。
[0007] 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的： 豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯活疫苗，其含有豬傳染性胃腸炎病毒弱 毒株HB08株和豬流行性腹瀉病毒弱毒株ZJ08株，所述的豬傳染性胃腸炎病毒HB08株的保 藏號為CGMCC No. 7807,病毒含量為IO6 5~108_°TCID5(l/ml，所述的豬流行性腹瀉病毒ZJ08株 的保藏號為CGMCC No. 7806,病毒含量為Kf5~10L5TCID5Q/ml。
[0008] 在本發明的實施方案中，所述二聯活疫苗還含有凍干保護劑。
[0009] 其中，所述的凍干保護劑優選為蔗糖明膠保護劑，其中明膠濃度2%~6%，蔗糖濃度 10%~35%。
[0010] 從河北省某豬場送檢豬傳染性胃腸炎抗原陽性的病料中分離到TGEV。將分離到的 豬傳染性胃腸炎病毒在ST細胞上連續傳代，從第125代開始0RF3基因連同前面的間隔區 序列出現81個核苷酸的缺失，至165代穩定缺失81個核苷酸。從第125代開始，TGEV對 仔豬失去致病性；將TGEV 145代種毒在豬體連傳5代，毒力依然很穩定，沒有任何返強現象 將125~165代致弱毒株種毒命名為豬傳染性胃腸炎病毒HB08株，并于2013年06月28 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為：CGMCC No. 7807。
[0011] 從浙江某豬場送檢豬流行性腹瀉抗原陽性的病料中分離到PEDV。將分離到的豬流 行性腹瀉病毒在Vero E6細胞上連續傳代，從第105代開始0RF3基因突然出現49個核苷 酸的缺失，至第145代均保持穩定缺失49個核苷酸序列。從第105代開始，PEDV對仔豬失 去致病性；將PEDV 125代種毒在豬體連傳5代，毒力依然很穩定，沒有任何返強現象 將105~145代致弱毒株種毒命名為豬流行性腹瀉病毒ZJ08株，并于2013年06月28 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為：CGMCC No. 7806。
[0012] 本發明還提供所述二聯活疫苗的制備方法，包括如下步驟： 1) 、分別制備豬傳染性胃腸炎病毒TGEV HB08株和豬流行性腹瀉病毒PEDV ZJ08株病 毒液； 2) 、將制備的TGEV和PEDV病毒液按照1:1~1:2的比例混勻后按7:1的比例加入凍干 保護劑，進行冷凍真空干燥，即得。
[0013] 其中，將豬傳染性胃腸炎病毒TGEV HB08株和豬流行性腹瀉病毒PEDV ZJ08株分 別以0. 5%~5%的接毒量接毒到生長良好的單層培養細胞ST和Vero E6細胞上，35°C~37°C 吸附0. 5~1. 5小時后，補足細胞生長維持液，繼續培養，當CPE達到80%~90%時收毒，獲得豬 傳染性胃腸炎病毒TGEV HB08株和豬流行性腹瀉病毒PEDV ZJ08株的病毒液。
[0014] 本發明還提供所述的二聯活疫苗在制備治療豬傳染性胃腸炎病毒和/或豬流行 性腹瀉病毒感染引起的疾病的藥物中的應用。
[0015] 將本發明制備的二聯活疫苗經肌肉注射3~5日齡TGEV、PEDV中和抗體均小于 1:8的母豬所產仔豬5頭，每頭10頭份，連續觀察14日，仔豬均無不良反應。
[0016] 將本發明制備的二聯活疫苗免疫TGEV、PEDV中和抗體均小于1:8的母豬所產的 3~5日齡仔豬10頭，各肌肉注射疫苗1頭份(病毒含量10 5_°TCID5(l/ml)，接種14日后，將 10頭仔豬分成2組，每組5頭，其中一組免疫仔豬，連同條件相同的對照仔豬5頭，分別口服 lOOOXMID/ml的豬傳染性胃腸炎病毒pi株Iml ;另一組免疫仔豬，連同條件相同的對照仔 豬5頭，分別口服1000 X MID/ml的豬流行性腹瀉病毒p55株lml，均觀察7日。結果二聯苗 接種豬均100%獲得保護，而對照組則100%發病死亡。
[0017] 將本發明制備的二聯活疫苗與市售商品苗進行對比試驗，結果經本發明免疫的仔 豬對強毒攻擊的保護率比市售商品苗的保護率高20個百分點。
【附圖說明】
[0018] 圖 I TGEV CPE 圖片（400X )。
[0019] 圖2 TGEV分離毒S基因PCR檢測結果。圖中，M :DNA Marker DL2000 ;1 :樣品； 2 :陰性對照。
[0020] 圖 3 TGEV 分離毒 0RF3 基因 PCR 擴結果。圖中，M :DNA Marker DL2000 ;1 :樣品； 2 :陰性對照。
[0021] 圖4不同代次TGEV 0RF3序列比對。
[0022] 圖 5 PEDV CPE 圖片（400X )。
[0023] 圖6 PEDV分離毒S基因 PCR檢測結果。圖中，1:樣品；2:陰性對照；M: DNA Marker DL2000。
[0024] 圖7 PEDV分離毒0RF3基因 PCR擴結果。圖中，1:樣品；2:陰性對照；M: DNA Marker DL2000。
[0025] 圖8不同代次PEDV (ZJ08株）0RF3序列比對。
【具體實施方式】
[0026] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0027] 實施例1弱毒株來源 一、豬傳染性胃腸炎病毒弱毒HB08株 取河北某豬場豬傳染性胃腸炎抗原陽性病料，按照1:5的比例(重量：體積)加入PBS， 反復凍融3次，離心取上清，0. 22 μ m濾膜過濾，濾液中加入終濃度為20 μ g/ml的胰酶，37°C 處理1. 5小時。
[0028] 按常規方法接種長滿單層的ST細胞，同時設置空白細胞作為對照。傳至第17代時 出現明顯、穩定的CPE變化（圖1)。根據S基因設計檢測引物對：S-F: 5 ' -TATTTGTGGTYTTGG TYGTAATGC-3' ；S-R: 5' -GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA-3'，以 95°C 45S、50°C 45S、72°C Imin 進行32個循環后，72°C延伸5min。擴增S基因片段為886bp，結果見圖2。
[0029] 擴增0RF3序列的引物為： 0RF3-F:AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3 ' 0RF3-R:CAACAGGAACCAGAAAAATGA-3， 擴增的片段的大小為1202bp (圖3) 將分離到的豬傳染性胃腸炎病毒在ST細胞上連續傳代120代，并在此過程進行了克隆 純化，然后繼續在ST細胞上傳代至165代。將第165代病毒進行RT-PCR檢測，擴增S基因 片段為886bp。
[0030] TGEV 0RF3基因序列在第20代、40代、70代、100代處于比較穩定的的狀態，有個 別堿基的變化，但沒有改變氨基酸；而第125代開始0RF3基因連同前面的間隔區序列出現 81個核苷酸的缺失(起始密碼子前30個核苷酸、后51個核苷酸連續81個核苷酸缺失)，第 125代、145代、165代穩定缺失81個核苷酸(序列如SEQ ID No. 5所示)。結果如圖4。
[0031] 按現行《中國獸藥典》附錄對第125~165代病毒進行無菌、支原體及外源病毒檢 驗，結果無細菌，霉菌，支原體及外源病毒污染。
[0032] 將分離到的TGEV 125-165代TGEV致弱株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編 號是CGMCC No. 7807,保藏時間是2013年6月28日。
[0033] 二、豬流行性腹瀉病毒弱毒ZJ08株 取浙江某豬場豬流行性腹瀉抗原陽性病料，按照1:5的比例（重量：體積)加入PBS，反 復凍融3次，離心取上清，0. 22 μ m濾膜過濾，濾液中加入終濃度為20 μ g/ml的胰酶，37°C處 理1. 5小時。
[0034] 按常規方法接種長滿單層的Vero E6細胞，同時設置空白細胞作為對照。傳至 第24代時出現明顯、穩定的CPE變化（圖5)。根據S基因設計檢測引物對：正向引物為 5' -GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3' ；反向引物為 5' -CGCACTCGGATTACTCACAGC -3'，95°C預變 性 5min，95°C 45s、50°C lmin、72°C 2min 進行 32 個循環后，72°C5min 延伸。PEDV 擴增片 段為484bp。結果見圖6。
[0035] 擴增0RF3序列的引物為： 0RF3-F: TCCTAGACTTCAACCTTACG 0RF3-R: GGTGACAAGTGAAGCACAGA 擴增的0RF3的片段的大小為：833 bp (圖7)。
[0036] 將分離到的豬流行性腹瀉病毒在Vero E6細胞上連續傳代100代，并在此過程進 行了克隆純化，然后繼續在ST細胞上傳代至145代。將第145代病毒進行RT-PCR檢測，擴 增S基因片段為484bp。
[0037] PEDV ZJ08株0RF3基因序列在第105代開始0RF3基因突然出現49個核苷酸的缺 失，至第145代均保持穩定缺失49個核苷酸序列，如SEQ ID No. 10所示。結果如圖8。
[0038] 按現行《中國獸藥典》附錄對第105~145代病毒進行無菌、支原體及外源病毒檢 驗，結果無細菌，霉菌，支原體及外源病毒污染。
[0039] 將分離致弱的105~145代致弱株種毒命名為PEDV ZJ08株