一種無創制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于動物實驗模型構建技術領域，具體地說，涉及一種無創制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法。
【背景技術】
[0002]目前慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的構建方法有很多，目前最長使用的方法包括:內毒素經氣管內注入加熏香煙法、氣管內滴入蛋白酶加二氧化硫刺激法、持續細菌感染加吸煙法、氣道內注入促彈性蛋白酶和脂多糖、氣道內注入蛋白酶加常壓低氧法、CaCl2聯合山黎豆類制劑。上述造模方法均需要氣道內滴入化學制劑，由于慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的構建時間較長，故造模過程中動物的存活率是一個很關鍵的問題。造模過程中氣道內滴入化學制劑的步驟相當關鍵，可以有氣管切開法、直視下給藥法、盲插法等，均屬于有創操作，對動物造成一定程度的損傷，會影響成型動物的存活數量以及質量。
[0003]氣管切開法:為有創操作，簡單易行，且在切開后，視野暴露良好，易于準確定位；但術后感染與否以及操作對于氣管局部以及周圍組織的破壞難以掌握，存活率低。
[0004]直視下給藥法:選取光源暴露聲門后，操作者在直視聲門的情況下，進行氣管內給藥的相關操作，較其他方法創傷小，器械和技術水平要求相應也降低，但選擇合適的光源清晰暴露聲門則是此法關鍵環節，多選用燈泡，冷光源，手電等透過頸部的光線。此時輔以牽拉舌根暴露聲門，但大鼠頭部狹長，聲門狹小并且在口腔深部，選用的給藥裝置如過粗或形態不能很好配合生理曲度時，在逐漸接近會厭部，則會擋住大部分視線，在聲門暴露的短暫時間內，較難準確插入聲門完成操作，并容易將給藥裝置誤入食管或因為視野不清反復多次插入造成喉頭水腫，氣道損傷，聲帶出血，嚴重時甚至大鼠死亡。
[0005]盲插法:經口氣管內給藥，在沒有暴露聲門的情況下，容易反復刺激喉部，造成粘膜水腫出血，氣道分泌物增加，導致氣道阻塞，另外極易將注射裝置誤入食道，成功率較低。經皮氣管內給藥，則需要從外部皮膚直接準確定位氣管位置并從環狀軟骨間隙給藥，對操作人的技術要求較高，否則容易多次刺激局部肌肉及筋膜等，給藥效果難以評估，還容易造成水腫出血，成功率低。
[0006]針對上述現有的操作技術，目前，需要一種操作方便，成功率高，損傷小且成本低廉的大鼠用氣管內給藥方法。
【發明內容】
[0007]為了克服現有技術中存在的缺陷，本發明提出了一種無創制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法。其技術方案如下:
[0008]一種無創制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法，包括以下步驟:
[0009]步驟1、菌株與細菌培養
[0010]肺炎鏈球菌標準菌株由天津市臨床檢驗中心提供，菌株號:ATCC49619，取菌株ATCC49619接種于血瓊脂培養皿，37°C培養18_24h，挑取單菌落接種THB液體培養基，37°C，200rpm/min振蕩培養12h，離心濃縮后，備用；
[0011]步驟2、實驗動物
[0012]清潔級Wistar雄性大鼠60只，月齡3_6個月，體重180 士 20g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格(許可)證號:SCXK(京)2009-0004 ;實驗大鼠喂養在天津實驗動物中心，飼養環境室內相對濕度為50% -60%，溫度控制在18-22°C ;常規飼料喂養，自由飲用水，按時通風沖刷糞便，保持環境安靜，適應性喂養I周后開始實驗；
[0013]步驟3、肺氣腫動物模型構建:
[0014]采用內窺鏡引導下氣管內灌注的滴注菌液方式，設備采用鼻O度4#硬式內窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監視系統；
[0015]將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內乙醚麻醉，麻醉滿意后迅速將鼠從麻醉器中取出，呈仰臥位狀以彈力固定夾將其四肢分別固定于鼠板上；
[0016]兩名操作者并排位于鼠頭頂方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉鏡，自鼠上唇齒伸入口腔、提壓鼠舌，伸至鼠會厭緣處時提拉鼠舌根，以右手持牽拉套圈，套住鼠上列長尖牙門齒，左右手同時相反方向上下牽拉舌根與長尖牙門齒，使鼠自唇齒至喉部間上呼吸暢通暴露聲門區域，此時主操作者以左手持O度硬式內窺鏡，右手持7號長針注射器，內裝定量造模所用肺炎鏈球菌菌懸液，在監視器顯示引導下將7號長注射針插入氣管內，并深入聲門下15?20mm，此時觀察鼠的聲帶活動情況，當雙側聲帶由內收狀向外展狀變化時，緩慢滴注6u 0.15ml彈性蛋白酶溶液7.7 μ /mg, Sigma公司，隨后注入100 μ I空氣，此時鼠呈吸氣階段，使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內，推注完畢后，將鼠板迅速立起鼠頭在上左右翻轉15?20秒，空白組不做處理，鹽水對照組注入同等量的無菌生理鹽水；每7天滴入一次，共3次，造模時間21天；
[0017]解除鼠四肢彈力固定夾將鼠放回鼠籠內待復蘇，鼠復蘇時間約30?60秒，然后置于恒溫動物房飼養；接種后每日觀察其活動、取食、精神的一般情況，記錄相應數據；
[0018]步驟4、制備肺炎鏈球菌瓊脂珠懸液:
[0019]肺炎鏈球菌標準菌株由天津市臨床檢驗中心提供，菌株號:ATCC49619 ;營養瓊脂平板培養后，調整細菌濃度為2X 1012-6X 1012CFU/ml，取濃縮菌液與45°C溶化的瓊脂溶液等量混合，迅速注入4°C快速攪拌的腦心浸液培養基中，制成由瓊脂包裹細菌的肺炎鏈球菌瓊脂珠懸液；懸浮液包含細菌濃度為lX1012-3X1012CFU/ml的不定形瓊脂珠。
[0020]本發明的有益效果為:
[0021]本發明使用的是無創手段氣管內滴入彈性蛋白酶以及肺炎鏈球菌的方法構建慢性阻塞性肺疾病動物模型。該方法通過無創的方法，減少了對動物的損傷，提高了成活率，保證了在較長時間的造模過程中動物能夠免于有創操作帶來的死亡。研宄發現每次能夠保證滴入足夠量的彈性蛋白酶能夠相對縮短造模時間，節省了時間的同時也節約了造模成本。
【附圖說明】
[0022]圖1為空白組動物肺組織HE染色(50倍);
[0023]圖2為模型組動物肺組織HE染色(50倍);
[0024]圖3為鹽水對照組動物肺組織HE染色(50倍)。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。一種無創制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法
[0026]步驟1、菌株與細菌培養
[0027]肺炎鏈球菌標準菌株由天津市臨床檢驗中心提供，菌株號:ATCC49619，取菌株ATCC49619接種于血瓊脂培養皿，37°C培養18_24h，挑取單菌落接種THB液體培養基，37°C，200rpm/min振蕩培養12h，離心濃縮后，備用。
[0028]步驟2、實驗動物
[0029]清潔級Wistar雄性大鼠60只，月齡3_6個月，體重180 士 20g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格(許可)證號:SCXK(京)2009-0004 ;實驗大鼠喂養在天津實驗動物中心，飼養環境室內相對濕度為50% -60%，溫度控制在18-22°C ;常規飼料喂養，自由飲用水，按時通風沖刷糞便，保持環境安靜，適應性喂養I周后開始實驗。
[0030]步驟3、肺氣腫動物模型構建:
[0031]采用內窺鏡引導下氣管內灌注的滴注菌液方式，設備采用鼻O度4#硬式內窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監視系統；
[0032]將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內乙醚麻醉，麻醉滿意后迅速將鼠從麻醉器中取出，呈仰臥位狀以彈力固定夾將其四肢分別固定于鼠板上；
[0033]兩名操作者并排位于鼠頭頂方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉鏡，自鼠上唇齒伸入口腔、提壓鼠舌，伸至鼠會厭緣處時提拉鼠舌根，以右手持牽拉套圈，套住鼠上列長尖牙門齒，左右手同時相反方向上下牽拉舌根與長尖牙門齒，使鼠自唇齒至喉部間上呼吸暢通暴露聲門區域，此時主操作者以左手持O度硬式內窺鏡，右手持7號長針注射器，內裝定量造模所用肺炎鏈球菌菌懸液，在監視器顯示引導下將7號長注射針插入氣管內，并深入聲門下15?20mm，此時觀察鼠的聲帶活動情況，當雙側聲帶由內收狀向外展狀變化時，緩慢滴注6u(0.15ml)彈性蛋白酶溶液(7.7 μ/mg，Sigma公司)，隨后注入10yl空氣，此時鼠呈吸氣階段，使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內，推注完畢后，將鼠板