一種具有高入胞效果的主動靶向脂質體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥用材料領域，涉及一種具有高入胞效果的主動靶向脂質體及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] 配體修飾脂質體是主動靶向給藥系統的常用遞藥策略，通過脂質體表面的配體與 靶細胞受體的特異性結合，將脂質體定點地傳遞入胞，從而實現減毒增效。NGR多肽即含門 冬酰胺-精氨酸-甘氨酸（asparagine-glycine-arginine)序列的多肽，它能特異性地與 表達氨肽酶（aminopeptidaseN，又名⑶ 13)的細胞結合。⑶13是一種跨膜金屬蛋白酶，是新 生血管生成的重要調節因子，在正常血管內皮細胞上未被激活，而在腫瘤新生血管的內皮 細胞上高度表達。因此，NGR修飾脂質體通過與腫瘤新生血管內皮細胞上的特異性配體⑶ 13 結合，將脂質體定位于腫瘤區域，抑制腫瘤新生血管的生成并使抗腫瘤藥物在腫瘤區域釋 放，從而達到靶向治療腫瘤的目的。
[0003] 脂質體主要由磷脂組成，采用不同磷脂材料制備的脂質體具有不同的相變溫度 (phase transition temperature，Tm)，當溫度低于脂質體的T#，脂質體磷脂雙分子層處 于固晶相（solid gel phase)，通透性低；當溫度達到或高于！^寸，磷脂雙分子層轉變為無 序液晶相（liquid disordered phase)，通透性高。本課題組前期研宄已表明，不同！^勺 隱形脂質體（stealth liposomes)在體內的革El向遞藥效率不同，且成功合成了 NGR導向磷 脂化合物，并驗證了靶細胞攝取效果。在此基礎上，本研宄以人成纖維肉瘤（HT1080)細胞 化0 13高度表達）為細胞模型，進一步考察了 Tm對NGR修飾主動靶向脂質體遞藥入胞效果的 影響。
[0004] 目前文獻報道的主動靶向脂質體分別采用不同Tm的磷脂材料修飾，例如 Ndinguri MW用一種兩親多肽（peptide-amphiphile，PA)與DSPC脂質體進行偶聯提高了革巴 向效果（Ndinguri MW, Zheleznyak A, Lauer JL, et al. Application of Collagen-Model Triple-HelicalPeptide-AmphiphiIes for CD44_Targeted Drug Delivery Systems [J]· J DrugDeliv, 2012, 2012:592-602.) ;Nallamothu R 用一種新型的抗血管劑 (combretastatinA4)成功制備了 HSPC祀向脂質體，并且具有較高的偶聯率和良好的革巴 向傳遞效（Nallamothu R, Wood GC, Pattillo CB, etal. A tumor vasculature targeted liposome delivery system for combretastatin A4:design, characterization, and in vitro evaluation[J].AAPS PharmSciTech. 2006,7(2):E32.);Kim MS 利用DPPC 脂質體 與環狀多肽（cRGD)偶聯制備了溫敏型脂質體增強了靶向入胞效果（Kim MS，Lee DW，Park K, et al. Temperature-triggered tumor-specific delivery of anticancer agents by cRGD-conjugated thermosensitiveliposomes[J]. Colloids Surf B Biointerfac es. 2014, 116:17-25.) 〇
【發明內容】
[0005] 本發明提供一種具有高入胞效果的主動靶向脂質體，用磷脂材料、隱形材料 DSPE-PEG2000、NGR導向磷脂化合物按摩爾比55 : 4. 36 : 0. 64配比，其中磷脂材料選自 氫化大豆磷脂HSPC或二硬脂酰磷脂酰膽堿DSPC。
[0006] 作為本發明的進一步改進，所述磷脂材料為氫化大豆磷脂HSPC。
[0007] 作為本發明的另一種改進，如權利要求1或2所述的具有高入胞效果的主動靶向 脂質體，其特征在于：用薄膜分散法制備，具體制備方法如下：按相應摩爾配比稱取磷脂材 料、隱形材料DSPE-PEG2000、NGR導向磷脂化合物，用氯仿溶解后旋轉蒸除氯仿并形成均勻 的薄膜，真空干燥過夜除去殘留的氯仿，加入PH7. 4磷酸鹽緩沖液PBS 37°C下水合，置脂質 體擠出儀下過200nm膜兩次，即得；其中所述磷脂材料選自氫化大豆磷脂HSPC或二硬脂酰 磷脂酰膽堿 DSPC，所述 pH7. 4 的 PBS 配制方法為：Na2HPO4 · 12H20 : NaH2PO4 · 2H20 : NaCl =53. 13 : 13. 33 : 75. 29。
[0008] 同時本發明提供上述具有高入胞效果的主動靶向脂質體的制備方法，按照如下方 法進行制備：按相應摩爾配比稱取磷脂材料、隱形材料DSPE-PEG2000、NGR導向磷脂化合 物，用氯仿溶解后旋轉蒸除氯仿并形成均勻的薄膜，真空干燥過夜除去殘留的氯仿，加入 PH7. 4磷酸鹽緩沖液PBS 37°C下水合，置脂質體擠出儀下過200nm膜兩次，即得；其中所述 磷脂材料選自氫化大豆磷脂HSPC或二硬脂酰磷脂酰膽堿DSPC，所述pH7. 4的PBS配制方法 為：Na2HPO4 ·12Η20 : NaH2PO4 ·2Η20 : NaCl = 53.13 : 13.33 : 75.29。
[0009] 作為本發明的進一步改進，所述旋轉蒸除氯仿的溫度為55°C，所述水合時間
[0010] 為lh，所述脂質體擠出儀中于IMPa氮氣壓力下過膜。
[0011] 有益效果
[0012] 本發明首次以NGR多肽為靶頭，選用磷脂材料HSPC或DSPC，用香豆素-6進行熒光 標記，采用薄膜分散法制備所得的NGR修飾香豆素-6脂質體，以HT1080細胞為模型，用流 式細胞實驗和激光共聚焦實驗表征藥物入胞效果，表明，本發明所構建的主動靶向脂質體 相比于現有技術具有更加優異的入胞效果，從而提高脂質體的靶向入胞性能，用其作為藥 劑材料制備載藥靶向脂質體可提高藥物的靶向性能。
[0013] 而同時優選方案中采用HSPC磷脂材料構建的主動靶向脂質體，其兼具高入胞性 能與廉價的優點，比較HSPC與DSPC、DPPC (二棕櫚酰磷脂酰膽堿）、DMPC (二肉豆蔻酰磷脂 酰膽堿）的價格可以發現，HSPC的價格約為其他磷脂材料的的1/10,因此，若選用HSPC構 建NGR主動靶向脂質體，將其開發為新型主動靶向材料將具有巨大的經濟效益。
【附圖說明】
[0014] 圖 I DSPC、HSPC、DPPC、DMPC 四種脂質體的 DSC 圖譜.
[0015] 圖2細胞密度對細胞攝取的影響（η = 3)。
[0016] 圖3 ΗΤ1080細胞攝取不同相變溫度NGR修飾脂質體的熒光強度比較（η = 3)。 [0017] 圖4不同相變溫度NGR修飾脂質體在ΗΤ1080細胞內的分布。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1具有高入胞效果的主動靶向脂質體
[0019] 采用如下技術方案制備：含有磷脂材料、隱形材料DSPE-PEG2000、NGR導向磷脂化 合物按摩爾比55 : 4.36 : 0.64配比，用氯仿溶解后旋轉蒸除氯仿并形成均勻的薄膜，真 空干燥過夜除去殘留的氯仿，加入PH7. 4磷酸鹽緩沖液PBS37°C下水合，置脂質體擠出儀下 過200nm膜兩次，即得。
[0020] 其中磷脂材料選自氫化大豆磷脂HSPC或二硬脂酰磷脂酰膽堿DSPC，NGR導向磷脂 化合物為含門冬酰胺-精氨酸-甘氨酸序列的多肽，PH7. 4磷酸鹽緩沖液PBS的配制如下： Na2HPO4 · 12H20 : NaH2PO4 · 2H20 : NaCl = 53. 13 : 13. 33 : 75. 29。
[0021] 實施例2實施例1制備所得主動靶向脂質體入胞效果的驗證
[0022] 本發明首次以NGR多肽為靶頭，選用四種不同相變溫度的磷脂材料，用香豆素-6 進行熒光標記，采用薄膜分散法制備NGR修飾香豆素-6脂質體，并以HT1080細胞為模型， 采用流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡觀察評價脂質體的入胞效果。實驗表明，NGR修飾的香 豆素-6脂質體包封率均在95%以上，且性質穩定。流式細胞實驗和激光共聚焦實驗均表 明，入胞效果呈現以下規律：DSPC ~ HSPC>DPPC>DMPC，其中DSPC