具有內化作用的酸敏感脂質體給藥系統及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及脂質體給藥系統，尤其涉及腫瘤靶向脂質體給藥系統及其制備方法， 屬于醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 由于生物相容性、生物可降解性，載藥多樣性，以及能夠提高藥物穩定性，脂質體 已經成為一種被廣泛應用的納米載體系統[1]。1995年第一個抗腫瘤藥物脂質體制劑阿霉 素脂質體被FDA首次批準，進入臨床[2]，其明顯改善了阿霉素的心臟毒性，但其藥效并沒 有顯著提高。為了增加藥物在靶區的蓄積進一步提高藥效，脂質體研究領域先后出現了具 有物理靶向性的pH敏感脂質體[3,4]，熱敏脂質體[5]，磁敏脂質體[6, 7]，配體或抗體修飾 的能夠實現主動靶向的免疫脂質體[8,9]以及多功能脂質體[10]。
[0003] 近20年來，靶向脂質體的修飾主要集中于受體介導[11-13]，受體介導的胞吞作 用實現了藥物在靶細胞的濃集。然而，當藥物及其載體以胞吞作用入胞后第一步形成胞內 體，然后被溶酶體吞噬，并在溶酶體內豐富酶作用下被降解，由此造成藥物難以從溶酶體逃 逸進入細胞質，限制了藥物到達真正的靶點如細胞核或線粒體等亞細胞器發揮作用實現藥 效。
[0004] 近年來，研究發現細胞穿透肽（cell penetrating peptides, CPP)因其富含精 氨酸殘基，可與細胞表面的陰離子物質，包括糖胺聚糖、膜磷脂頭部等，發生強烈的相互作 用，激活細胞的攝取[14,15]。尤其當CPP攜載的藥物進入細胞形成胞內體被溶酶體融合 后，CPP上的氨基可吸附H+，使細胞質中的Cl-內流進入，造成溶酶體內滲透壓增加，最終 使溶酶體破裂，藥物從溶酶體釋放于細胞質和細胞核[16]，為其充分發揮藥效提供了前 提，這種效應被稱作"質子海綿效應"。弗.哈夫曼-拉羅切有限公司申請了 PCT中國專利 CN103096932A，發明了一種具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ的TAT肽的內化效力至少80%， 優選至少90%的效力內化入細胞，可攜載核酸和蛋白轉化或轉染一個或多個細胞，在預防 和/或治療選自癌癥、免疫疾病、心血管疾病、神經疾病、感染和炎性疾病的病癥中具有一 定的用途。但遺憾的是，目前為止發明的細胞穿透肽（CPP)均缺乏組織和細胞特異性[17]， 其在穿透腫瘤細胞的同時，對于正常細胞也有促攝取作用，由此造成了對正常組織的損害。 為進一步發揮CPP對腫瘤組織的選擇性和靶向性，有文獻報道[18]用靶細胞特異性配體如 RGD和CPP共同修飾載體系統，利用RGD等對腫瘤的特異性將CPP "帶"到腫瘤實現CPP的 穿透內化作用。另外，中國專利CN102552929A發明了由屏蔽肽、酶解底物肽、穿膜肽順序連 接形成可激活細胞穿透肽，利用PSA敏感性發明了一種給藥系統，改善了 CPP的靶向性。但 這種系統設計較為復雜不易實現大生產，以及尚存在免疫原性等問題，因此限制了其實際 應用。
[0005] 此外，如我們所知，在脂質體發展過程中，用聚乙二醇（poly (ethylene glycol)， PEG)衍生物對脂質體膜層的修飾是一座歷史的里程碑[19]。然而，PEG對脂質體的修飾是 一把"雙刃劍"。其在消弱了脂質體與調理素作用的同時，也將減弱長循環脂質體達到靶部 位時與靶細胞的相互作用，甚至PEG鏈的水化層阻礙了所連接的配體、抗體的"靶向"作用， 降低靶向輸送和細胞攝取的效率[20]。上述中國專利CN102552929A中CPP即用聚乙二醇 連接后修飾于脂質體表面，這種聚乙二醇水化層對于CPP作用的發揮具有"阻礙"作用，不 能充分發揮CPP的作用。
[0006] 眾所周知，腫瘤部位的pH明顯低于正常組織和血液[21]，腙鍵在低pH時容易水 解斷裂。因此，PEG通過腙鍵連接于脂質體表面使得這種酸敏感脂質體能夠最優發揮其在 腫瘤部位的作用，也就是說在體循環PH7. 0條件下，PEG穩定存在于脂質體表面起到"保護 作用"，而在腫瘤低pH值的酸性區域，鏈接PEG的腙鍵斷裂使得PEG "離開"脂質體表面促 進細胞對脂質體的攝取。Kale，A.A. and Torchilin，V.P. [22]·曾經提出一種TATp修飾的 pH敏感脂質體，其中TATp通過與短鏈聚乙二醇（PEG1000 )-PE偶合形成TATp-PEGlOOO-PE 插入脂質體表面，聚乙二醇長鏈mPEG2000通過腙鍵與PE偶聯（mPEG2000-HZ-PE)插入脂質 體表面實現酸敏感的長循環。這種酸敏感給藥系統雖然在一定程度上提高了 CPP的對于腫 瘤的選擇性，但依然沒有考慮并改善PEG的水化層的阻礙作用，沒有使CPP的作用充分發揮 出來。除此之外，長循環酸敏感部分mPEG2000-HZ-PE中所用到的PE是具有兩個長鏈有機 酸的磷脂分子，其具有較小的臨界膠束濃度，在該酸敏感脂質體制備中更易形成膠束而難 以插入脂質體表面，在制備中存在酸敏感偶合物修飾率低的問題。
[0007] 針對Kale, A. A. and Torchilin，V. P.設計的這種酸敏感脂質體中存在的問題， 我們設計了一種簡單有效的CPP修飾的酸敏感脂質體，其中CPP與硬脂酰（STR)直接偶聯 修飾脂質體表面，避免了 PEG的"阻礙"作用，另外，用單鏈有機酸（如硬脂酸STR)合成了 mPEG20000-Hz-STR，其中用單鏈STR代替了雙鏈PE，較（mPEG2000-HZ-PE)有更高的臨界膠 束濃度，在脂質體制備中不易形成膠束，反而更容易插入脂質體表面，實現長循環性。這種 簡單有效的靶向脂質體制劑兼具體內長循環、腫瘤物理靶向以及細胞穿透內化三種特性， 能同時實現抗腫瘤藥物在腫瘤區的高效定位濃集和快速細胞穿透兩個目的。而且該制劑制 備簡單，易于大生產，對所有腫瘤具有廣譜適用性，有望助于腫瘤靶向給藥制劑在臨床應用 上零的突破。
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