用于雙特異性t細胞銜接體(bites)的制劑的制作方法
【專利說明】用于雙特異性T細胞銜接體（BITES)的制劑
[0001] 本發明涉及穩定的藥物組合物，其含有具有至少兩個抗原_結合結構域的多肽且 尤其適于皮下施用。本發明提供液體組合物，其將不期望的多肽團聚體（二聚體和/或多 聚體）的形成減至最低。本發明進一步提供用于在液體組合物中將具有抗原-結合結構域 的多肽團聚降至最低的方法。
[0002] 在現有技術中已知需要使溶液中的抗體穩定化（即防止形成二聚體和多聚體） (已知為高分子量或HMW團聚體），以維持治療活性恒定。W02011061712公開了穩定的抗體 制劑，除了 25-250mg/ml抗體以外，其含有10-30 mM緩沖劑（優選為乙酸鹽、琥珀酸鹽、磷 酸鹽、組氨酸或其組合）、1-15%多元醇以及0. 001-0. 05%潤濕劑。組合物的pH為5-7. 5之 間。
[0003] W02010148337 (Al) (^Lyophilized formulation for small modular immunopharmaceuticals")公開了已知為小免疫藥劑蛋白（SMIP)的組合物。這些是由多重 融合結構域（例如抗原-結合結構域、免疫球蛋白鉸鏈區和Ig分子的G2或C H3區或自其 衍生的區域）組成的構建體。SMIP的結構域由多肽組成，所述多肽是基因序列的產物，其 可以是人、非人或人工（使用基因技術方法所產生）來源。盡管SMIP蛋白優選為單特異性 的，但該申請還公開了多特異性變體，例如蝎分子（Scorpion molecules)。它們含有SMIP 蛋白，其具有進一步C端結合結構域。蝎分子的結合結構域優選結合至不同的目標結構且 因此適于作為免疫特異性治療劑。W02010148337 (Al)公開了凍干組合物的穩定制劑，其含 有SMIP，其中少于7%的SMIP以團聚形式存在。所述制劑可進一步包含緩沖劑、穩定劑、填 充劑、潤濕劑和其它賦形劑。W02009070642 Al公開了 BiTE分子MT103的各種制劑，其第一 結合結構域特異性結合至T細胞受體抗原CD3，而第二結合結構域特異性結合至B細胞抗原 ⑶19。所述BiTE分子在7. 0的pH在公開的組合物中是穩定的，至高達300呢/ml的最大 濃度。所用緩沖劑是檸檬酸鹽。所述制劑適于靜脈內和皮下施用。在皮下施用之后的生物 利用度為10-50%。
[0004] IgG抗體具有大恒定區（CH1_3/Q區），這是其大部分物理化學特性的原因。具 有不同特異性的IgG抗體在結構上主要在'和V h區內的高變抗體結合位點的區域 (CDR1-CDR3)中不同。由于恒定區大，所以個別IgG變體之間的結構和物理化學差異相對地 小。如IgG抗體，W02010148337(A1)中所述的SMIP分子含有恒定抗體結構域的部分。
[0005] 相比之下，具有不同特異性的BiTE分子在其物理化學特性上顯著不同。作為由 不同免疫球蛋白的兩個單鏈可變片段（scFv)idR.構成的融合蛋白，它們缺乏恒SC H1_3/Q 區，因此在抗原-結合結構域中的差異涉及BiTE分子的區段比IgG或SMIP抗體的區段大 得多。同樣地，BiTE分子MT103和本發明中使用的BiTE分子主要在其分子結構上不同。盡 管MT103中的結構域以順序Vf VH-VH-Vjf列，但本發明中優選使用的BiTE分子排列是形式 Vh-Wt。此外，兩種分子的順序在許多位置處不同。
[0006] BiTE分子的這些特性及其小尺寸在不同BiTE分子的物理化學行為上產生明顯差 異。這導致需要針對各個別應用開發個別制劑（以增加物理化學穩定性），這是由于無法使 用個別BiTE或類似分子的制劑，或僅可以有限制地使用，用于替代應用。
[0007] 在一個實施方案中，存在于組合物中的多肽是已知為雙特異性T細胞銜接體 (BiTE)的多肽。在一個特定實施方案中，BiTE具有特異性結合至T細胞受體-CD3復合體 的e鏈的第一結合結構域，以及特異性結合至前列腺-特異性膜抗原（PSM)的第二結合 結構域。PSMA是一種整合II型膜蛋白，其以高度特異性表達在前列腺上皮細胞上，且在前 列腺癌的情況下強度增加。此外，PSM由實體腫瘤的新形成血管表達。PSM-BiTE因此介 導細胞毒性T細胞和這些目標細胞之間的直接接觸。
[0008] 蛋白（例如BiTE分子）的團聚體形成在藥物應用中是不期望的，例如生物活性成 分的效力或利用度可能由于團聚體形成而改變。
[0009] 這導致提供以抑制不期望的團聚體形成的方式容許BiTE分子穩定的制劑的目 標。
[0010] 解決方案描述于本申請和權利要求中，且涵蓋BiTE制劑，其包含TRIS和磷酸鹽。 在其優選的實施方案中，所述制劑包含pH 6.0的50mM磷酸鹽、IOOmM TRIS、0. 04%聚山梨醇 酯80和4%海藻糖二水合物，且能夠就形成團聚體而言穩定具有PSMA-BiTEl分子的制劑。 這適用于范圍低于Mg/ml的低濃度和>2mg/ml的高濃度兩者。穩定效果對于本領域技術 人員而言是令人驚訝的，因為，例如，在W02009070642 Al中使用的檸檬酸鹽，甚至作為pH 6. 0的50mM檸檬酸鹽和IOOmM TRIS的組合，也沒有表現出該效果。例如，在相當的組合物 (其僅含有檸檬酸鹽取代磷酸鹽）中所測量的二聚體分數為7.0%。相比之下，根據本發明 的組合物將二聚體分數限制在0. 8%(參見表6和7)。組合使用TRIS和磷酸鹽是組合物的 穩定效果的原因。為了也在剪切力方面穩定BiTE分子，需要濃度為至少0. 04%的潤濕劑諸 如聚山梨醇酯80,因為二聚體分數否則將太大（約7. 5%，見表15)。為了防止PSMA-BiTEl 分子吸附在注射器、輸注袋等的容器壁上，具有僅〇. 002%聚山梨醇酯80是足夠的。
[0011] 如本文所使用的術語"抗體"是指免疫球蛋白分子，其各自包含經由二硫鍵而彼此連接 的兩個重（H)多肽鏈以及兩個輕（L)多肽鏈。每一重鏈由可變區（Vh )和恒定區組成，恒 定區又由三個結構域（CH1、CH2*CH3)組成。每一輕鏈是由可變區（')和恒定區)構 成。輕鏈和重鏈兩者的的可變區（V#P VJ在各情況下均進一步再分為三個超變抗體結合 位點（CDR1-CDR3)，以及在CDR之間總共四個保守區（FR1-FR4)。
[0012] 術語"單克隆抗體"描述源自相同的抗體群體的抗體，其除了相對少量的天然存在 的突變或翻譯后修飾以外是相同的。與作為免疫反應的部分出現的多克隆抗體相比之下， 單克隆抗體針對特異性表位。
[0013] "雙特異性"或"雙功能性抗體"是一種人工、雜合抗體，其具有兩對不同的重鏈和 輕鏈，且還有兩個不同的抗原-結合位點。
[0014] 以木瓜蛋白酶處理抗體產生兩個相同的抗原-結合Fab片段和可結晶Fc片段。 "Fab片段"由完整的' 鏈和部分重鏈（即含有可變區的Vh結構域和第一恒定結構域ChI) 組成。每一 Fab片段因此具有個別的抗原-結合位點。"Fc片段"包含兩個重鏈的羧基-端 部分，其經由二硫鍵連接。Fc片段的部分被其它細胞的Fc受體所識別并經由其決定抗體的 效應子功能。
[0015]胃蛋白酶在二硫鍵下切割抗體，而這樣兩個Fab片段經由鉸鏈區保持連接并形成 單一"F(ab'） 2片段"。其具有兩者抗原-結合位點且因此如完整抗體能夠交聯抗原。
[0016] 術語"結構域"描述蛋白的球形區域，其具有定義并獨立折疊的結構。IgG抗體的 輕鏈由兩個結構域構成（在各情況下，一個恒定結構域和一個可變結構域）；重鏈由四個結 構域構成（在各情況下，三個恒定結構域和一個可變結構域）。兩個可變區各自由重鏈的一 個結構域和輕鏈的一個結構域構成。
[0017] 術語"表位"或"抗原決定簇"描述抗體（或其抗原-結合片段）特異性結合的抗 原區域。表位可由連續氨基酸，或者因為三級蛋白折疊而彼此緊鄰的不連續氨基酸組成。
[0018]"抗原"是具有抗體可結合的"抗原決定簇"的分子（例如蛋白、多肽、肽和碳水化 合物）。
[0019] 術語"構型"是指蛋白或多肽（例如抗體、抗體鏈、結構域或其部分）的三級結構。
[0020] "特異性結合"特定多肽或特定多肽上的表位，或對該結構"特異性"的抗體相當不 那么有效地結合至替代結構。
[0021] 術語"scFv抗體"在本申請中是指人工產生的抗體片段，其由抗體的共價鍵合的Vh 和'結構域組成。兩個結構域均存在于單一多肽鏈中并經由由多個氨基酸構成的多肽接 頭彼此連接。除了 Fc-介導的效應子功能以外，scFv抗體保留抗體的所有功能，更特別是 其選擇性和親和力。
[0022] "雙特異性T細胞銜接體" (BiTE)分子是重組蛋白構建體，其由兩個彈性連接的單 鏈抗體（scFv)構成。所述scFv抗體之一特異性結合至選擇的目標細胞表達的腫瘤抗原， 第二種特異性結合至⑶3, T細胞上的T細胞受體復合體的一個亞單位。BiTE抗體能夠暫 時地使T細胞結合至目標細胞，同時活化T細胞的細胞溶解活性。T細胞的BiTE-介導的活 化既不需要T細胞上的特異性T細胞受體，也不需要目標細胞上的MHC I分子、肽抗原或共 刺激分子。
[0023] 術語"穩定性"和"穩定的"在含有BiTE分子的化合物的背景下描述抗體或其片 段在涉及其生產、制備、儲存、使用或運輸的給定條件下對團聚、降解或片段化的抗性。根據 本發明的"穩定"制劑在給定生產、制備、運輸、使用和儲存條件下保留其生物活性。
[0024] 存在于溶液中的蛋白（例如BiTE分子）對于如在生產、填充和運輸期間發生的機 械運動是敏感的。超過特定強度的移動，分子會團聚和/或變性。含有蛋白的液體組合物 因此在機械運動期間暴露于已知為攪動應激下。在"攪動應激測試"中，對含有蛋白的液體 組合物使用受控制的機械（攪動）力來分析不同組合物中溶解蛋白的團聚和變性行為。
[0025] 蛋白在攪動應激測試中的行為是其對剪切力（如例如在溶液以套管抽吸和注射 期間發生）的物理穩定性的指標。
[0026]"凍干"描述一種干燥方法，其基于升華的原理。待干燥的物質首先冷卻低至 約_45°C，隨后施加真空而物質加熱至約-20°C。結果，冰晶直接升華至氣態而未經過液體 中間步驟。以這種方式干燥的物質在第二干燥步驟之后（仍在真空下）在約25°C含有少于 5%的其初始水分且被稱為"凍干物"。
[0027] 在施用于患者之前，凍干物進行"重構（rekonstituieren) "，即溶解于藥學上可接 受的稀釋劑。"重構制劑"在本發明的背景下通過將凍干的抗體制劑溶于此類稀釋劑中而形 成。抗體隨后呈溶解的形式并可被施用于患者。
[0028] "多元醇"描述一組有機化合物，其含有多個羥基（-0H)(多元醇、多羥基醇）。多 元醇諸如蔗糖或海藻糖是能夠穩定抗體和/或影響組合物的摩爾滲透壓濃度的糖。
[0029] 為了防止蛋白在凍干期間不期望的降解或團聚，添加所謂的"凍干保護劑"。這些 是，例如，糖或糖醇，諸如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。在本發明的背景 下，海藻糖是優選使用的凍干保護劑。
[0030] 術語"潤濕劑"在本文中是指任何具有親水區和疏水區的去污劑且包括非離子型、 陽離子型、陰離子型和兩性離子型去污劑。可用去污劑涵蓋，例如，聚氧乙烯山梨糖醇單油 酸酯（也已知為聚山梨醇酯80或TWEEN 80)、聚氧乙烯山梨糖醇單月桂酸酯（也已知為聚 山梨醇酯20或TWEEN 20)或N-月桂基肌氨酸。對于本文公開的組合物，優選非離子型潤 濕劑。對于本發明的組合物，尤其優選使用聚山梨醇酯80。潤濕劑可以0. 002%至0. 1%的 濃度使用。
[0031] 術語"緩沖劑"在本文中描述緩沖的溶液，在添加酸性或堿性物質后其pH僅略微 改變。緩沖的溶液含有弱酸和其對應堿或弱堿和其對應酸的混合物。
[0032] 術語"患者"是指接受預防性或治療性治療的（人或動物）個體。
[0033] 術語"治療"在本文中是指使用或施用治療性物質至患者，或使用或施用治療性物 質至患者的分離組織，或至患者的細胞系，所述患者