一種抗血栓形成和內膜增生的小口徑生物人工血管的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程技術，具體是關于將神經營養因子創新性用于修飾生物人工血管，構建一種具有抗血栓形成和內膜增生功能的生物人工血管。
【背景技術】
[0002]據WHO最新統計，全球心血管疾病的發病率和死亡率逐年攀升。心血管疾病已經超過腫瘤成為嚴重威脅著人類健康的殺手，每年有17.3千萬人死于心血管疾病。使得血管移植物的臨床需求在全球范圍內日益增大。外周血管閉塞或損傷替代、冠狀動脈旁路移植、血液透析動靜脈造瘺等都需要小口徑血管移植物。現在肝、腎、肺等復雜器官構建以及大段骨缺損修復等都需要血管化，移植后血管的再通往往是影響構建器官能否存活并宿主化的關鍵，因而小口徑血管的移植和構建也是復雜器官構建的關鍵科學問題之一。人體自身非必需血管的長度和直徑極為有限，用人工材料構建小直徑血管不易成型，同時很難做到順應性相匹配。而且合成材料血管植入物移植后I年中，血栓形成和內膜增生的發生率在40%-60%。Niklason等科學家提出自體動靜脈、PTFE合成血管移植物已經是上世紀血管搭橋的選擇。而構建不需要體外種植內皮細胞的“現用型”組織工程血管才是未來發展的方向。但是小口徑組織工程血管(<6mm)移植后由于早期血栓形成、中遠期內膜增生、鈣化等問題一直制約著其進一步的臨床運用。因此構建一種能夠抗血栓形成和內膜增生的生物人工血管迫在眉睫。
[0003]研宄表明，通過促進內皮祖細胞(EPCs )的動員和迀移分化可促進血管損傷后的內皮化。EPCs主要存在于骨髓中，在血管內皮細胞損傷或局部缺血的情況下從骨髓動員出來并且歸巢到血管受損部位或缺血局部分化為內皮細胞替代凋亡的內皮細胞，促進血管再內皮化和血管新生，進而減少內膜增生，減少血栓形成，降低血管的再狹窄率。因此，體內誘導自體內皮祖細胞的捕獲和歸巢為促進組織工程血管和人工血管的自體內皮化提供了新的機遇。
[0004]由于在生物體內，血管和神經總是伴行的，血管和神經的生長方式非常相似，它們循著相同的迀移路線，相互依賴，血管的活動和營養受神經調節。目前在構建血管組織工程時尚未引入神經調節因素，這種因素對構建功能完整的組織工程血管起何種促進作用尚不得而知。神經營養因子是重要的神經因素，對血管內皮維持正常功能有重要作用。神經生長因子(NGF)作為神經營養因子家族的重要一員，它對促進神經元生長和神經損傷后修復發揮著重要作用。有研宄發現它也可以促進內皮細胞的增殖和生長，與毛細血管、以及小動靜脈血管的發生有關。NGF與內皮細胞上的TrkA結合可以觸發內皮細胞的增殖、迀移，并上調內皮細胞粘附分子的表達，促進血管發生。但是，NGF是否能夠促進EPCs的動員、歸巢從而推進組織工程血管的內皮化還不清楚。
[0005]冠狀動脈和勁內外動脈都要受第十對腦神經迷走神經分支的支配。迷走神經在頸部發出喉上神經和頸心支，分布于頸內動脈并參與構成心叢，繼續發支構成左右冠狀動脈叢，支配左右冠狀動脈。迷走神經發自腦部延髓橄欖后溝中部，據研宄報道，延髓部富含腦源性神經生長因子BDNF。BDNF作為神經營養因子家族成員，是腦源性神經營養因子。已有研宄發現BDNF不僅對神經生長和突觸的可塑性有重要作用，而且在整個圍血管形成期作用于心臟、骨骼肌和大動脈等特定器官組織。但是，BDNF是否對構建用于冠狀動脈和頸動脈替代的小直徑組織工程血管通暢率有影響，目前尚不清楚。
[0006]神經肽(NP)是一種由多個氨基酸組成的多肽，廣泛存在于中樞和外周神經系統，也對血管舒縮、內皮細胞和平滑肌細胞的增殖有調控作用。其中神經肽Y(NPY)誘導堿性成纖維生長因子(bFGF)及血管內皮生長因子(VEGF)等下游介質的表達來對血管發揮調節作用。NPY同時能讓缺血組織的血管實現再通。上調NPY、Y2/Y5受體和DPPIV的表達，形成新的毛細血管，在阻塞的動脈形成新的肌動脈，NPY通過這種方式改善血流及患肢功能。但是神經肽是否能調控小直徑生物人工血管的體內構建，尚不清楚。
【發明內容】
[0007]本發明針對小口徑生物人工血管的巨大需求和面臨的難題，首次將神經營養因子用于修飾生物人工血管。在技術上解決因子有效偶聯并保持活性的技術難題，在功能上通過誘導內皮祖細胞主動捕獲來促進內皮化，發揮抗血栓形成和內膜增生的關鍵作用。提供一種臨床上血液透析、外周血管替代、冠脈搭橋可用的“現用型”小口徑生物人工血管。為實現本發明的上述目的而采用的技術方案，即構建一種抗血栓形成和內膜增生的小口徑生物人工血管，包括以下步驟:(I)制備血管基質材料:①以天然脫細胞血管基質材料作為支架材料，利用該支架材料采用傳統制備生物人工血管支架的方法制備生物人工血管支架；或②采用膠原蛋白、蠶絲絲素或聚乳酸構成單組分的靜電紡絲，或利用膠原蛋白/蠶絲絲素、蠶絲絲素/聚乳酸或膠原蛋白/聚乳酸構成雙組分的靜電紡絲，采用電紡絲技術制備生物人工血管支架；或③采用3D打印技術打印出生物人工血管支架。
[0008](2)修飾血管基質材料:用70%_90%的N—磺酸一光交聯一殼聚糖硫酸酯、0.5%-5%d彈性蛋白、10%-20%d膠原、0.05%-0.l%d肝素及0.005%-0.05%d R⑶孵育所述生物人工血管支架。
[0009](3)偶聯神經營養因子:通過3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯或殼聚糖、聚乳酸-羥基乙酸共聚物或環糊精，與神經營養因子偶聯經步驟(2)處理的生物人工血管支架，從而得到生物人工血管。
[0010]以上技術方案可以按照如下原理進行更具體地描述:
1、小口徑血管支架材料的質量控制:①以天然脫細胞血管材料作為支架材料，采用有效的病毒滅活措施確保動物源性生物材料的安全性。在此基礎上通過高效溫和的脫細胞方法，有效脫去細胞，并通過酶法有效去除DNA、RNA等免疫原性成分，同時保留血管的彈力纖維、膠原纖維等細胞外基質的活性和功能。采用慣用的制備生物人工血管支架的方法制備出具有良好生物相容性，有效去除免疫原性，小口徑(< 6mm)生物人工血管支架。②低溫酶解除去異種動物來源的抗原，得到三螺旋結構的I型膠原。成功制備高純度具有光交聯特性的生物膠原，以醫用生物膠原為前驅體而生產制備已完全達到靜電紡絲和血管材料要求。利用高純度、高分子量的蠶絲絲素，進行膠原蛋白、蠶絲絲素及聚乳酸的單組分靜電紡絲和膠原蛋白/蠶絲絲素、蠶絲絲素/聚乳酸、膠原蛋白/聚乳酸雙組分靜電紡絲。根據生物膠原與蠶絲絲素不同的溶解特性，經多次改進實驗方法，實現將生物膠原與蠶絲絲素蛋白混紡的技術。③篩選可降解和高生物相容性的高分子物質，制備能快速成型的粉末狀材料，根據臨床需求可3D打印出任何口徑和任何長度的生物人工血管支架。
[0011]2、血管支架材料的修飾:針對傳統脫細胞支架材料力學性能不強的難題，采用N—磺酸一光交聯一殼聚糖硫酸酯，0.5%-5%d彈性蛋白、10%-20%d膠原、0.05%-0.l%d肝素及0.005%-0.05%d R⑶肽復合，運用快速成型技術制備成具有良好力學特性、適于原位血管再生的可控降解材料體系。
[0012]3、功能分子的有效偶聯及表征:NGF是一個多功能多肽分子。針對NGF包含α、β、γ三個亞單位，活性區是β亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結合而成的二聚體。藥用鼠源性NGF與人體NGF的結構具有高度的同源性，生物效應也無明顯的種間特異性，現在廣泛用于臨床。通過3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯對神經因子進行偶聯，加NGF與膠原分子有效偶聯。并通過免疫熒光染色技術表征血管腔面所偶聯到的NGF分子的數量和密度。BDNF分子單體是由119個氨基酸殘基組成的分泌型成熟多肽，主要由β折疊和無規N-級結構組成，含有3個二硫鍵，為一種堿性蛋白質，分析表明BDNF的氨基酸序列有相當一部分與NGF相同。同樣采用3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯對神經因子進行偶聯，BDNF與膠原分子有效偶聯。并通過免疫熒光染色技術表征血管腔面所偶聯到的BDNF分子的數量和密度。篩選可降解和高生物相容性的材料，如殼聚糖、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)或者環糊精等，將NPY通過化學交聯、冷凍干燥或者紫外交聯的方法制備出能快速成型的粉末狀材料，進行3D打印。
[0013]本發明中神經因子修飾的小口徑生物人工血管具有抗血栓形成和內膜增生的作用:首次發現NGF能夠促進內皮祖細胞的動員和歸巢，并誘導內皮祖細胞向內皮細胞分化。BDNF能夠促進早期內皮祖細胞旁分泌從而誘導周圍正常內皮細胞迀移并進一步誘導晚期內皮祖細胞歸巢。在此基礎上本發明所構建的神經營養因子修飾的生物人工血管能夠主動捕獲血液中循環的內皮祖細胞，并且誘導內皮祖細胞原位內皮化。內皮層發揮抗血小板聚集、抗內膜增生等生物功能，從而保持小口徑生物人工血管通暢，并且具有明顯的抗血栓形成和內膜增生的功能。NPY通過誘導毛細血管新生促進滋養血管滲入植入血管支架材料，從而為血管支架提供營養，促進植入血管存活并逐漸被宿主血管替代。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發明的內容作進一步說明:本發明所用材料和試劑均為市購產品，所用方法無特殊說明均為本領域常用方法。
[0015]1、血管支架材料制備:①在無菌條件下，取同種或異種個體的頸總動脈，用生理鹽水將血液沖洗干凈。在37°C，用胰酶脫細胞后用PB