紐蘭格林制劑的配方的制作方法
【技術領域】
[0001] -般來說，本發明涉及治療心血管疾病比如心力衰竭的藥物制劑。特別地，本發明 涉及紐蘭格林藥物制劑的配方。
[0002] 發明背景
[0003] 在美國，大約有5百萬人患有心衰，并且每年新增病人在55萬以上。目前治療心 衰的藥物主要集中于血管緊張素轉化酶（ACE)抑制劑，這些血管舒張劑引起血管擴張、降低 血壓并減少心臟負荷。雖然使用ACE抑制劑后死亡率的百分數下降是具有統計學差異的， 但實際的死亡率僅平均下降3%_4%，并且還有一些潛在的副作用。其他預防或治療心衰的選 擇亦有相應的局限。比如，心臟移植顯然比藥物治療更昂貴且更具侵入性，并且還進一步受 有無供體心臟的限制。使用機械裝置，比如雙心室心臟起搏器，同樣具有侵入性并且比較昂 貴。因此，由于當前治療手段的不足，人們需要有新的治療方法。
[0004] -種很有前途的新的治療手段涉及給心衰患者或有心衰風險的患者施用紐蘭格 林(此后稱為"NRG")。NRGs屬于表皮生長因子樣（EGF-Iike)家族，是一類結構上相似的生 長分化因子，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4及其異構體。NRGs涉及一系列生物學反應：刺 激乳腺癌細胞分化和分泌乳汁蛋白；誘導神經嵴細胞分化成Schwann細胞；刺激骨骼肌細 胞合成乙酰膽堿受體；并且促進心肌細胞成活和DNA合成。用紐蘭格林基因嚴重缺陷的純 合子小鼠胚胎做活體研究證明紐蘭格林對于心臟和神經發育是必須的。
[0005] NRGs與EFG受體家族的成員結合，該受體家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4， 其中每一個受體在多種細胞功能中都發揮重要的作用，包括細胞生長、分化和存活。它們都 是蛋白酪氨酸激酶受體，由一個胞外配體結合域、跨膜激酶域和胞漿的酪氨酸激酶結構域 組成。NRG結合至ErbB3或ErbB4的細胞外結構域后，能夠誘導構象改變從而引起ErbB3、 ErbB4和ErbB2之間形成異二聚體，或者ErbB4自身形成同源二聚體，這樣就會導致受體細 胞內C-末端結構域的磷酸化。然后磷酸化的胞內結構域與細胞內其他的信號蛋白結合，活 化相應的下游AKT或ERK信號傳導途徑，并誘導一系列的細胞反應，比如刺激或抑制細胞增 殖、細胞分化、細胞凋亡、細胞遷移或細胞粘附。在這些受體中，ErbB2和ErbB4主要在心臟 表達。
[0006] 已有研究表明NRG-I的EGF類似區，約50至64個氨基酸，足以結合并活化這些受 體。以前的研究表明紐蘭格林-1 β (NRG-1 β )能以高親和力直接結合ErbB3和ErbB4。孤 兒受體ErbB2能與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體并且其親和力比ErbB3或ErbB4同源二 聚體要高。神經發育的研究結果提示交感神經系統的形成需要完整的NRG-I β、ErbB2和 ErbB3信號傳導系統。靶向破壞NRG-I β、或ErbB2或ErbB4后由于心臟發育缺陷而導致胚 胎致死。最近的研究也突顯了 NRG-I β、ErbB2和ErbB4在心血管發育以及維持成年正常心 臟功能方面具有重要作用。研究表明NRG-I β能增強成年心肌細胞的肌小節的組織結構。 短期施用一種重組的NRG-I β EGF類似區能顯著改善或防止不同心衰動物模型的心肌功能 的惡化。這些效應使得NRG-I有望成為一種治療多種普通疾病導致的心衰的廣譜治療物或 先導化合物。通常，蛋白質類藥物制劑的給藥方式為靜脈注射。然而眾所周知，一些活性蛋 白存在著穩定性差的問題。因此，開發一種穩定的紐蘭格林藥物制劑是非常必要的。
[0007] 發明概述
[0008] 本發明所提供的一種紐蘭格林的藥物配方包含：（a)紐蘭格林多肽；（b) -種緩沖 齊Ll，使所述配方pH值為3-7。在一些實施例中，紐蘭格林配方進一步包括：（c)一種穩定劑。 在一些實施例中，紐蘭格林還包括：（d)-種鹽。在一些實施例中，該配方為一種液體制劑。 在一些實施例中，該配方為一種凍干制劑。
[0009] 配方中所述紐蘭格林多肽選自以下物質：a) -種包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序 列的多肽；b)-種包含紐蘭格林的EGF類似區的多肽；c)一種a)所述多肽的生物活性類似 物，片段或突變體；d) -種由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列編碼的多肽；e) -種d)所述多 肽的生物活性類似物，片段或突變體；f)一種由可在適度嚴格的雜交條件下與SEQ ID NO: 1 所示多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽。在一些實施例中，紐蘭格林多肽是指包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽。在一些實施例中，紐蘭格林多肽的濃度范圍約為0.0 lg/ L-lg/L。在一些實施例中，本發明所述配方中紐蘭格林多肽為包含SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列的多肽且濃度約為〇. 25g/L。
[0010] 在一些實施例中，本發明所述配方包含一種pH緩沖劑。在所述實施例中，pH緩沖 劑的濃度范圍約為0. lmM-500mM。緩沖劑選自檸檬酸鹽，磷酸鹽，醋酸鹽，組氨酸，甘氨酸，碳 酸氫鹽，HEPES，Tris，稀鹽酸，稀氫氧化鈉溶液或以上物質的組合。在一種實施例中，本發明 所述配方中的緩沖劑是磷酸鹽。在一些實施例中，本發明所述配方的pH值約為6.0。在一 些實施例中，本發明所述配方的pH值約為3. 4。
[0011] 在一些實施例中，本發明所述配方包含一種穩定劑。在進一步的實施例中，穩定劑 的濃度范圍約為0. lg/L-200g/L。在另外的實施例中，穩定劑選自甘露醇，山梨醇，木糖醇， 蔗糖，海藻糖，甘露糖，麥芽糖，乳糖，葡萄糖，棉子糖，纖維二糖，龍膽二糖，異麥芽糖，阿拉 伯糖，葡萄糖胺，果糖，人血清白蛋白及或以上物質的組合。在一些實施例中，穩定劑指濃度 約為2g/L的人血清白蛋白。
[0012] 在另外一些實施例中，本發明所述配方包含一種鹽。在一些實施例中，鹽的濃度約 為100mM-500mM。在一特定實施例中，鹽是指氯化鈉。在相關實施例中，配方中鹽的濃度約 為 150mM。
[0013] 在一些實施例中，本發明所述配方中的紐蘭格林多肽包含SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列，其中緩沖劑約為IOmM的磷酸鹽，pH值約為6. 0。
[0014] 在一些實施例中，本發明所述配方中所含的NRG多肽是SEQ ID NO:2所示氨基 酸序列的多肽且濃度約為〇. 25g/L，所含的緩沖劑是濃度約為IOmM的磷酸鹽且pH值約 為6.0,所含的穩定劑是濃度約為2g/L的人血清白蛋白，所含的鹽是氯化鈉且濃度約為 150mM〇
[0015] 在一些實施例中，本發明所述配方是液體藥物制劑。在進一步實施例中，本發明所 提供的紐蘭格林液體藥物制劑配方包含的紐蘭格林多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的 多肽且濃度約為0. 25g/L，所述緩沖劑約為IOmM磷酸鹽且其中所述pH約為3. 4。
[0016] 在一些實施例中，本發明所述配方是由上述任一配方加入賦形劑后凍干而成的凍 干藥物配方。在一些實施例中，賦形劑選自人血清白蛋白，甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇或以上 物質的組合。在一特定實施例中，賦形劑為甘露醇。在相關實施例中，約60mg的所述配方 用Iml重懸溶液重懸后賦形劑的濃度約為0. lg/L-200g/L。在一特定實施例中，約60mg的 所述配方用Iml重懸溶液重懸后甘露醇的濃度約為50g/L。
[0017] 在進一步實施例中，本發明所提供的紐蘭格林凍干藥物配方包含：（a) -種紐蘭 格林多肽；（b) -種緩沖劑；（c) 一種賦形劑。在另外一些實施例中，凍干的藥物制劑配方 進一步包含一種穩定劑。在另外一些實施例中，凍干的藥物制劑配方進一步包含一種鹽。
[0018] 在一特定實施例中，本發明所述的凍干藥物制劑配方包含：（a)SEQ ID N0:2所示 氨基酸序列的多肽；(b)磷酸鹽緩沖劑；（c)賦形劑甘露醇；（d)穩定劑人血清白蛋白和（e) 鹽氯化鈉，約60mg的所述配方用Iml重懸溶液重懸后（a)的濃度為0. 25g/L ; (b)的濃度為 IOmM且pH值約為6 ; (c)的濃度為50g/L ; (d)的濃度為2g/L ; (e)的濃度為150mM。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1 :重組人紐蘭格林（rhNRG-Ι)稀釋液和濃度為0· 25mg/mL標準溶液的色譜圖
[0021] 圖 2 :pH3-10 的 SDS-PAGE 色譜圖
[0022] 圖3 :在溫度為40°C、pH3_8條件下的濃度-時間圖
[0023] 圖4 :在溫度為40°C、pH2. 3-4. 3條件下的濃度-時間圖
[0024] 圖5 :在溫度為50°C、pH2. 3-4. 3條件下的濃度-時間圖
[0025] 圖6 :在溫度為60°C、pH3_8條件下的濃度-時間圖
[0026] 圖7 :儲存在溫度為60°C、pH2. 3-4. 3條件下的濃度-時間圖
[0027] 圖8 :在pH3_8條件下的pH值-降解速率圖
[0028] 圖9 :在pH2. 3-4. 3條件下的pH值-降解速率圖
[0029] 圖10 :在pH2. 3-8條件下的pH值-降解速率圖
[0030] 圖11 :pH值-預期保質期T (90)圖
[0031] 圖12 :pH3-8、40°C條件下