多價肺炎球菌多糖-蛋白質結合物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及多價免疫原性組合物，包含：通過將源自肺炎鏈球菌血清型1、2、3、4、 5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F的莢膜多糖（capsularpolysaccharide)結合 至載體蛋白如CRM197制備的15種不同的多糖-蛋白質結合物（綴合物，conjugate)。本發 明總體上涉及醫學領域，并且具體涉及微生物學、免疫學、疫苗以及通過免疫預防嬰兒、兒 童和成人中的肺炎球菌疾病。
【背景技術】
[0002] 肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)是肺炎的主要原因。根據國家統計局 公布的2010死亡趨勢原因，肺炎是10大死亡原因之一，每100, 000人中有14. 9人死亡，比 2000年增加82. 9%。世界衛生組織（WHO)還估算了在2012年，全球小于5歲的476, 000例 HIV陰性兒童死于肺炎鏈球菌感染，對于小于5歲的兒童，其占各種原因死亡兒童的5%。
[0003] 在1977年，RobertAustrian博士研制出14價肺炎球菌多糖疫苗來預防肺炎球 菌疾病，之后該疫苗發展至23價多糖疫苗。已經證明多價肺炎球菌多糖疫苗對于預防中老 年人和高危患者中的肺炎球菌疾病是有用的。然而，由于T細胞獨立的免疫應答，所以嬰兒 和幼兒對大多數的肺炎球菌多糖應答很差。7價肺炎球菌結合疫苗（7vPnC，Prevnar?:)包 含來自7種最普遍的血清型4、68、聽、14、18(：、19?和23?的莢膜多糖。自從2000年在美國 獲得批準，已經證實Prevnar是高度免疫原性的并且有效抵抗嬰兒和幼兒中的侵襲性疾病 和中耳炎。現在，該疫苗在全世界約80個國家獲得批準。Prevnar分別在美國、歐洲和世界 的其他地區覆蓋了大約80-90 %、60-80 %和40-80 %的侵襲性肺炎球菌疾病（Iro)。正如預 期的，在引入Prevnar后的幾年中收集的監測數據已經清楚地證實，在美國由被Prevnar覆 蓋的血清型引起的侵襲性肺炎球菌疾病降低。然而，血清型的覆蓋率限于一些地區，并且由 沒有被Prevnar覆蓋的血清型（特別是19A)引起的侵襲性肺炎球菌疾病增加。
[0004]咨詢委員會的免疫實踐（TheAdvisoryCommitteeonImmunizationPractices， ACIP)在2010年2月公布了對于用于接種新批準的13價肺炎球菌結合疫苗（PCV-13)的建 議。PCV-13是包含除包含在Prevnar中的7種血清型（4、6B、9V、14、18C、19F、23F)之外的 6種另外的血清型（1、3、5、6A、7F、19A)的肺炎球菌結合疫苗。根據美國活性細菌核心監測 (ActiveBacterialCoresurveillance，ABCs)，在已知為小于5歲的兒童中的致病血清型 的IPD病例中的總共64%被PCV-13覆蓋。在2007年，在小于5歲的兒童的4600例IPD中 的僅70病例被PCV7覆蓋，而2900病例被PCV-13覆蓋，其占主要部分。現在，正在研制15 價肺炎球菌結合疫苗，其覆蓋發病率隨血清型替換而增加的另外的血清型。
【發明內容】
[0005] 因此，本發明提供了用于預防嬰兒、兒童和成人的肺炎球菌疾病的多價免疫原性 組合物，該多價免疫原性組合物包含源自15種肺炎球菌血清型、包括血清型2和9N的莢膜 多糖。
[0006]具體地，本發明提供 了包含血清型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F 和23F的15價肺炎球菌結合物（PCV-15)組合物。
[0007] 技術方案
[0008] 根據本發明的一個方面，提供了多價免疫原性組合物，其包含15種不同的多 糖-蛋白質結合物和生理用載體，其中，每種結合物包含源自結合至載體蛋白的肺炎鏈球 菌的不同血清型的莢膜多糖，并且莢膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、 19A、19F和 23F制備。
[0009] 在根據本發明的多價免疫原性組合物中，載體蛋白可以是CRM197。根據本 發明的多價免疫原性組合物可以進一步包含佐劑，例如，包含鋁類（鋁基，基于鋁的， aluminum-based)佐劑的佐劑。佐劑可以選自由磷酸錯、硫酸錯和氫氧化錯組成的組，并且 優選的是磷酸鋁。
[0010] 根據本發明的進一步方面，提供了用于誘導對肺炎鏈球菌莢膜多糖結合物的免疫 應答的藥物組合物，該藥物組合物包含免疫學有效量的所述免疫原性組合物。
[0011] 在一個實施方式中，藥物組合物可以是被配制為包含以下的免疫原性組合物：除 了在4yg的6B，2yg的每種糖；大約34ygCRM197載體蛋白；0? 125mg元素錯（0? 5mg磷酸 鋁）佐劑；和作為賦形劑的氯化鈉和琥珀酸鈉緩沖液。
[0012] 技術效果
[0013] 多價免疫原性組合物包含源自15種不同的肺炎球菌血清型（包括血清型2和9N) 的莢膜多糖，從而導致升高的血清IgG效價（滴度，titer)和功能性抗體活性。因此，可以 將該多價免疫原性組合物有利地用于預防嬰兒、兒童和成人中的肺炎球菌疾病。
【附圖說明】
[0014] 圖1至圖15示出了在二次注射本發明的和比較例（Prevnar7和Prevnar13)的 疫苗組合物3周后（即，總共6周），測得的血清型特異性IgG的水平。
【具體實施方式】
[0015] 發明模式
[0016] 已經通過具有抗生素抗性和多重抗藥性的一些血清型進行了血清型替 換。血清型分布的地區差異導致地區覆蓋Prevnar的差異。（HarboeZB,Benfield TL,Valentiner-BranthP，etal.TemporalTrendsinInvasivePneumococcalDisease andPneumococcalSerotypesover7Decades.ClinInfectDis2010;50:329-37)。因 此，沒有理由除去現有的肺炎球菌結合疫苗中的任何血清型。相反，需要通過添加血清型進 一步擴大覆蓋率。
[0017]在2008年，全球肺炎球菌血清型項目（PneumococcalGlobalSerotypeProject， GSP)發布了基于選擇的1980年至2007年的iro數據的報道，示出繼血清型18C之后，血清 型2是前20個全球血清型中第11個最高發病率的血清型。此外，SamirK.Saha等人報道 血清型2可能成為威脅，因為血清型2具有在孟加拉國引起肺炎球菌性腦膜炎的高可能性， 但是沒有被包含在任何肺炎球菌結合疫苗中（SahaSK，AlEmranHM，HossainB，Darmstadt GLjSahaS,etal. (2012)StreptococcuspneumoniaeSerotype-2ChildhoodMeningitis inBangladesh:ANewlyRecognizedPneumococcalInfectionThreat.PLoSONE2012 ； 7 (3) :e32134)。因此，如果包含血清型2,則可以降低肺炎球菌疾病的數量，并且可以進一步 為接種PCV-13可能發生的血清型替換做準備。
[0018] 肺炎球菌血清型示出不同的年齡分布格局。具體地，已經發現，與24個月至59個 月大的兒童相比，血清型9N對0個月至23個月大的嬰兒相對重要。血清型9N是繼包含在PCV-13中的13血清型之后第14個最常見的。這表明包含血清型9N將有助于減少特別是 嬰兒中的肺炎球菌疾病。
[0019] 本發明提供了包含源自15種肺炎球菌血清型（包括血清型2和9N)的莢膜多糖的 多價免疫原性組合物。具體地，本發明提供了包含以下的多價免疫原性組合物：15種不同 的多糖_蛋白質結合物和生理用載體，其中，每種結合物包含來自結合至載體蛋白的肺炎 鏈球菌的不同血清型的莢膜多糖，并且該莢膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、 14、18C、19A、19F和 23F制備。
[0020] 莢膜多糖可以由本領域技術人員已知的標準技術制備。為了減少活化的莢膜多糖 的粘度或增加其溶解度，可以降低莢膜多糖的大小。在本發明中，由肺炎鏈球菌的血清型1、 2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制備莢膜多糖。通過分離方法制備這些 肺炎球菌結合物，并且將其配制成單劑量的制劑。例如，使每種肺炎球菌多糖血清型在大豆 基（基于大豆的，soy-based)培養基中生長，然后通過離心、沉淀、和超過濾純化。
[0021] 載體蛋白優選的是無毒的和非反應原性的并且可得到充足量和純度的蛋白。載 體蛋白應當可進行標準結合程序。在本發明的多價免疫原性組合物中，載體蛋白可以是CRM197。CRM197是從生長在基于酪蛋白氨基酸（casaminoacid)和酵母提取物的培養基上的 棒狀桿菌白喉菌株C7 (M97)的培養物分離的白喉毒素的無毒變體（S卩，類毒素）。通過超 過濾、硫化銨沉淀和離子交換色譜法純化CRM197。可替代地，根據美國專利號5, 614, 382重 組制備CRM197。
[0022] 其他白喉毒素也適于用作載體蛋白。其他合適的載體蛋白包括滅活的細菌毒素如 破傷風類毒素、百日咳類毒素；霍亂類毒素（W02004/083251);大腸桿菌（E.coli)