用于治療肝纖維化的結締組織生長因子嵌合疫苗及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于肝纖維化治療藥物領域，具體涉及一種用于治療肝纖維化的結締組織 生長因子嵌合疫苗及其應用。
【背景技術】
[0002] 肝纖維化（liverfibrosis)是肝臟對各種原因所致肝損傷的創傷愈合反應，表現 為肝內結締組織增生與沉積。肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發展必經的病理過程，是 決定慢性肝病預后的最主要因素之一。目前，大部分慢性肝病都缺乏有效的病因治療，而且 研宄證實部分肝病在病因去除后肝纖維化仍可繼續進展，故阻滯或延緩肝纖維化的發生發 展，從而防止其進展為肝硬化成為慢性肝病治療的主要途徑之一。但目前尚無真正意義上 安全、有效的抗肝纖維化藥物或措施，探索安全有效的抗肝纖維化措施是目前肝病學研宄 領域面臨的重要課題。
[0003]結締組織生長因子（connectivetissuegrowthfactor,CTGF)，是新近發現的一 種強力的促進肝纖維化因子，在肝纖維化發生發展過程中起著中心作用。CTGF是分泌型蛋 白，是高度保守的CCN家族成員之一，具有促進細胞增殖，促進細胞外基質沉積，介導細胞 粘附，刺激細胞迀移，促進軟骨形成及骨骼發育等多種生物學作用。CTGF在肝纖維化肝組織 中表達上調，其表達水平與肝纖維化程度正相關。
[0004]乙肝病毒核心抗原（heptitisBcore，HBc)是乙肝病毒（hepatitisBvirus， HBV)的重要結構蛋白，免疫原性強，是機體CTL識別的主要靶抗原之一。HBc融合異源表 位后在原核和真核細胞內均能高效表達，并且可以裝配成球形病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP)。HBc顆粒的TIAg特性是其再無佐劑時也能誘導Thl應答，且可通過B 細胞提呈進而啟動T細胞應答，提高HBc免疫原性。融合外源序列的嵌合HBc顆粒可以 引起強烈的免疫應答反應，明顯提高插入序列的免疫原性。HBc的N端、C端及MIROnajor immunodominantregion)區均可供外源短肽插入，并維持正確的構象，增強其免疫原性，但 MIR區的免疫原性更強。HBc顆粒載體由于其強力的免疫原性在疫苗研宄中具有重要價值。
[0005] 將自體蛋白的抗原表位插入乙肝病毒核心抗原的MIR表位制備成的嵌合疫苗是 一種新型疫苗。這種新型疫苗借助HBc顆粒載體打破機體對自體蛋白質的免疫耐受，使機 體發生針對自體蛋白特定的抗原表位的免疫應答。刺激機體產生的抗體可以有效地結合靶 蛋白，并且中和該靶蛋白的生物學活性。這些特點使得嵌合疫苗在疾病治療中極具應用價 值。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種用于治療肝纖維化的結締組織生長因子嵌合疫苗及 其應用。
[0007] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0008] -種嵌合疫苗，該嵌合疫苗是將結締組織生長因子的抗原表位插入乙肝核心抗原 的c/elB細胞表位中裝配而成；所述結締組織生長因子的抗原表位的氨基酸序列如SEQ.ID.NO. 1 所示。
[0009] 所述c/eIB細胞表位為乙肝核心抗原的第79至第81位氨基酸。
[0010] 結締組織生長因子的抗原表位插入乙肝核心抗原的c/elB細胞表位中，裝配成乙 肝核心病毒樣顆粒的嵌合疫苗。
[0011] 所述乙肝核心病毒樣顆粒是由180或240個乙肝核心抗原組成的亞單位構成。
[0012] 所述的乙肝核心抗原是含有第1至第149位氨基酸的截短型分子。
[0013] 本發明的嵌合疫苗在制備抗肝纖維化的藥物中的應用。
[0014] 所述的藥物為抑制肝臟肝星狀細胞激活程度的藥物。
[0015] 所述的藥物為刺激肝細胞增殖的藥物。
[0016] 所述的藥物為抑制肝細胞凋亡的藥物。
[0017] 所述的藥物為降低肝組織中TGF-M、TOGF及TMP-I蛋白質表達水平的藥物。
[0018] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0019] 本發明公開了一種用于治療肝纖維化的CTGF嵌合疫苗，通過將CTGF的抗原表位 插入乙肝核心抗原的c/elB細胞表位，構建可以裝配成乙肝核心樣顆粒的CTGF嵌合疫苗。 該嵌合疫苗在無佐劑的輔助下，仍然可以刺激機體產生高效價的抗CTGF中和性抗體。用該 嵌合疫苗免疫后的小鼠，經四氯化碳誘導后產生的肝纖維化程度明顯減輕。
[0020] 通過實驗驗證，本發明的CTGF嵌合疫苗免疫可以明顯抑制小鼠肝臟中的肝星狀 細胞的激活程度，同時還可以刺激肝細胞增殖，抑制肝細胞凋亡。另外，免疫后小鼠體內的 轉化生長因子0I(transforminggrowthfactor0 1，TGF-0 1)及血小板衍生的生長因子 (platelet-derivedgrowthfactor,F1DGF)的水平也明顯下降，這極有利于減緩肝纖維化 的進程。結果表明，CTGF嵌合疫苗可以成功抑制四氯化碳誘導的小鼠的肝纖維化。因此， CTGF嵌合疫苗有望被開發為治療肝纖維化的有效手段。
【附圖說明】
[0021] 圖1-1為重組蛋白HBcA的原核表達及純化圖；圖1-2為重組蛋白HBcACTGF138_15i3 的原核表達及純化圖；
[0022] 圖2-1為重組蛋白HBcA在透射電鏡下的形態圖；圖2-2為重組蛋白 HBcACTGF138_159在透射電鏡下的形態圖；
[0023] 圖3為重組蛋白HBcA及HBcACTGF138_1H#j激機體產生的抗體滴度圖；
[0024] 圖4為驗證CTGF多克隆抗體的Westernblot圖；
[0025] 圖5為Westernblot法檢測體外培養的HSCT6細胞中a-SMA表達水平圖；
[0026] 圖6為Real-time法檢測體外培養的HSCT6細胞中C0L1A2的mRNA水平圖；
[0027] 圖7為Real-time法檢測體外培養的HSCT6細胞中TMP-I的mRNA水平圖；
[0028] 圖8為免疫及造模時間圖；
[0029] 圖9為經肉眼觀察的小鼠肝臟形態圖；其中，（a)為正常組、（b)為 HBcACTGF138_159/CC14組、（c)為HBcA/CCl4組、（d)為CCl4組；
[0030]圖10為小鼠肝組織天狼猩紅染色圖；其中，（a)為正常組、（b)為HBcACTGF138_159/ CCl4組、（C)為HBcA/CCl4組、（d)為CCl4組；
[0031] 圖11為小鼠肝組織羥脯氨酸含量測定分析圖；
[0032] 圖12為小鼠肝組織中a-SMA表達的免疫組化染色圖；其中，（a)為正常組、（b)為 HBcACTGF138_159/CC14組、（c)為HBcA/CCl4組、（d)為CCl4組；
[0033] 圖13為圖12中各組小鼠肝組織中a-SM表達面積的統計分析圖；
[0034] 圖14為小鼠肝組織中Desmin表達的免疫組化染色圖；其中，（a)為正常組、（b)為 HBcACTGF138_159/CC14組、（c)為HBcA/CCl4組、（d)為CCl4組；
[0035] 圖15為圖14中各組小鼠肝組織中Desmin表達面積的統計分析圖；
[0036] 圖16-1為Westernblot法檢測各組小鼠肝組織中a-SMA的表達水平圖；
[0037] 圖16-2為Westernblot法檢測各組小鼠肝組織中a-SMA的表達水平的統計分 析圖；
[0038] 圖17為小鼠肝組織中PCNA染色檢測肝實質細胞增殖圖；其中，（a)為正常組、（b) 為HBcACTGF138_159/CC14組、（c)為HBcA/CCl4組、（d)為CCl4組；
[0039] 圖18為圖17中各組小鼠肝組織中PCNA染色檢測肝實質細胞增殖的統計分析圖；
[0040] 圖19為小鼠肝組織中TUNEL法檢測肝實質細胞凋亡圖；其中，（a)為正常組、（b) 為HBcACTGF138_159/CC14組、（c)為HBcA/CCl4組、（d)為CCl4組；
[0041] 圖20為圖19中各組小鼠肝組織中TUNEL法檢測肝實質細胞凋亡的統計分析圖；
[0042] 圖21為Real-time法檢測肝組織中CTGF的mRNA水平圖；
[0043] 圖22-1為Westernblot法檢測各組小鼠肝組織中Smad2信號通路圖；
[0044] 圖22-2為各組肝組織中磷酸化的Smad2蛋白在總Smad2蛋白中多占比例的統計 分析圖；
[0045] 圖23-1為Westernblot法檢測各組小鼠肝組織中TGF- 0 1的表達水平圖；
[0046] 圖23-2為各組肝組織中TGF-M的表達水平的統計分析圖；
[0047] 圖24-1為Westernblot法檢測各組小鼠肝組織中TOGF的表達水平圖；
[0048] 圖24-2為各組肝組織中TOGF的表達水平的統計分析圖；
[0049] 圖25-1為Westernblot法檢測各組小鼠肝組織中TMP-I的表達水平圖；
[0050] 圖25-2為各組肝組織中TMP-I的表達水平的統計分析圖。
【具體實施方式】
[0051] 本發明提供一種用于治療肝纖維化的CTGF嵌合疫苗，成功將CTGF的抗原表位插 入乙肝核心抗原的c/elB細胞表位，構建可以裝配成乙肝核心樣顆粒的CTGF嵌合疫苗。針 對的CTGF的抗原表位如SEQ.ID.NO. 1所示的氨基酸序列為：SMDVRLPSroCPFPRRVKLPGK。該 疫苗在無佐劑的輔助下，仍然可以刺激機體產生高效價的抗CTGF中和性抗體。該疫苗免疫 后的小鼠，經四氯化碳誘導后產生的肝纖維化程度明顯減輕。在進一步的研宄中我們發現 CTGF嵌合疫苗免疫可以明顯抑制小鼠肝臟中的肝星狀細胞的激活程度，同時還可以刺激肝 細胞增殖，抑制肝細胞凋亡。另外，免疫后小鼠體內的TGF-M及TOGF的水平也明顯下降， 這極有利于減緩肝纖維化的進程。結果表明，CTGF嵌合疫苗可以成功抑制四氯化碳誘導的 小鼠的肝纖維化。下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明 的解釋而不是限定。
[0052]I、HBcA及HBcACTGF138_159原核表達質粒的構建
[0053] (1)擴增HBc A編碼序列
[0054] 分別以PCR法從攜帶有HBc (ayw)全長編碼區的質粒pYTAl上擴增出編碼HBc aa 1一78和aa 82 - 149的DNA片段。引物如下：
[0055] l)HBc aa 1 - 78 :
[0056]上游引物：5'-
[0057] GGGAATTCATGATTACGCCAAGCTTGGCTGCAGAGTTCCATATG - 3r
[0058]下游引物：5'-
[0059] CCGCTCGAGTCCACCTCCACCACTTCCACCTCCACCATCTTCCAAATTAACACCCAC - 3r
[0060] 2) HBc aa 82 - 149：
[0061]上游引物：5'-
[0062] CGGGATCCGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTAGAGACCTAGTAGTCAGT - 3r
[0063] 下游引物：5'-
[0064] CCCAAGCTTCTAATGATGATGATGATGATGTCCACCTCCAACAACAGTAGTCTCCGG - 3r
[0065]其中HBc aa 1