壁虎蛆蟲蛋白質在制備抗黑色素瘤藥品中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種壁虎蛆蟲蛋白質的新用途，尤其是壁虎蛆蟲蛋白質在制備抗黑色 素瘤藥品中的應用。
【背景技術】
[0002] 惡性黑素瘤是由皮膚和其它器官黑素細胞產生的腫瘤，皮膚黑素瘤表現為色素性 皮損在數月或數年中發生明顯改變。
[0003] 由于黑色素細胞起源于神經嵴，廣泛分布于皮膚、眼、黏膜表面和神經系統等，因 此，惡性黑色素瘤可以在皮膚、口腔、消化道、生殖系統的黏膜、眼球的睫狀體、虹膜、脈絡膜 以及腦膜等處發生。
[0004]惡性黑色素瘤大多是由良好黑色素痣轉化而來。環境因素、遺傳因素、嚴重的化 學、光損害及藥物侵蝕都可以引發生成惡性黑色素瘤。
[0005]治療方案一般采用外科手術治療、放療、化療、內分泌治療、生物治療、生物化學治 療，中醫則將病癥分為風濕熱毒、外郁肌膚型，肝郁氣虛、瘀毒凝滯型，肝腎陰虛、肌膚失養 型三種類型，對癥治療。
[0006] CN103417953A公開了重組靈芝免疫調劑蛋白（rLZ-8)在制備治療黑色素瘤藥物 中的應用。該發明采用原位瘤和轉移瘤實驗動物模型研宄重組靈芝免疫調節蛋白的抗腫瘤 作用。
[0007] CN102067828A公開了人黑色素瘤高轉移模型、細胞亞系以及建立方法和轉移的動 態檢測。該發明采用肺轉移灶在小鼠肺轉移用體內篩選的方法建立了皮下移植模型及相應 的細胞亞系。
[0008] CN103952367A公開了一種發酵培養基及利用其生產黑色素瘤治療性質粒DNA疫 苗pSVK-CAVA的方法。該發明描述了發酵培養基的組成，并描述了其生產方法。
[0009] CN102805859A公開了作為體內造血刺激劑的TAT-H0XB4H重組蛋白質及其醫療組 成物。本發明涉及一種C-端含有組氨酸標記的H0XB4H重組蛋白質的制備方法，該重組蛋 白質應用于增加骨髓內以及周邊血液內的造血干細胞的數量。
[0010] CN102847144A公開了一種提高機體免疫功能的細胞類生物藥物及其制備方法和 應用。該發明表述了以免疫細胞與特定抗原在培養基中培養并獲得相應抗原的特異性免疫 細胞培養物，然后后處理分離出具有免疫應答的細胞，用于治療和預防腫瘤及病毒性疾病。
[0011] CN102924578A公開了抗腫瘤多肽及其制備方法和抗腫瘤應用。該發明提供了一種 具有抗腫瘤功能的多肽的制備方法，該多肽包括內皮抑素N端鋅離子結合位點的3個組氨 酸結構，一個0折疊結構及串聯的RGD系列。
【發明內容】
[0012] 本發明的目的是提供一種壁虎蛆蟲蛋白質在制備抗黑色素瘤藥品中的應用，根據 黑色素瘤的病灶特性及壁虎蛆蟲蛋白質生物活性特點，兩者相結合制備的藥劑具有適應性 強、療效好的特點。
[0013] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的： (1)將1000 g壁虎蛆蟲在常溫膨化裝置（200520108339. X)中常溫條件下膨化粉碎。
[0014] 本步驟中，所述膨化壓力為0? l~5MPa，時間為10~60min。
[0015] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出壁虎蛆蟲蛋白質粗品。
[0016] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O組成或由l~10Kg液態二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0017] 本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時間為10~30min。
[0018] (3)收集含有壁虎蛆蟲蛋白質粗品的溶液并且用微孔過濾器過濾去掉雜質。
[0019] 本步驟中，所述微孔過濾器的孔徑為0. 5~50Mffl。
[0020] (4)用超濾機超濾處理，收集含有相應分子量的壁虎蛆蟲蛋白質超濾溶液。
[0021] 本步驟中，所述超濾機的孔徑為50~100nm。
[0022] (5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0023] 本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0024] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0025] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0026](7)純化后的壁虎蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機制備成凍干蛋白粉。
[0027] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_30~50°C、時間為18~26h。
[0028] (8)賦予不同的藥用輔助材料，可用于制備抗黑色素瘤藥品。
[0029] 本技術方案中分離的純化壁虎蛆蟲蛋白質經聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向聚丙烯酰 胺凝膠電泳及瓊脂聚糖免疫電泳譜上測得非均一蛋白質；用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 及葡聚糖凝膠G-75凝膠過濾法測得相對分子量為10. 9~12. 6KPa;用等電聚焦發測定其等 電點為PH8. 8~10. 2;常規化學法分析結果表明其不含糖基；紫外分光光度法測定純化的壁 虎蛆蟲蛋白質含量為96. 7%。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限如此，凡是對 本發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵 蓋在本發明的保護范圍中。
[0031] 實施例1: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至0. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ? H2O,加壓至2~10MPa，形成膨 脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓 至常壓，生成壁虎蛆蟲蛋白質粗品與甲醇-NH3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過濾器過濾去處固 體雜質； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應分子量的壁虎蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外檢測器波長260~280nm ; (7) 純化后的壁虎蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~501：、時間18~2611干燥制 備成凍干蛋白粉。
[0032] 實施例2: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至0. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液態二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ? H2O,加壓至5MPa，形成膨脹溶劑體系，保持 溫度15°C，時間20min，壁虎蛆蟲粉體中的蛋白質溶解，然后降壓至常壓，生成壁虎蛆蟲蛋 白質粗品與甲醇-NH 3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆蟲蛋白質粗品的溶液，用孔徑30Mm的微孔過濾器過濾去處固體雜 質； (4) 溶液用孔徑IOOnm的超濾機超濾處理，壓力0. 5MPa，溫度為常溫，收集含有相應分 子量的壁虎蛆蟲蛋白質超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化預處理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用1〇~80%的乙腈梯度脫洗，流速 5mL/min，收集相關梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率I. 0KW，頻率500KHz，流速200mL/ min，紫外檢測器波長260nm ; (7) 純化后的壁虎蛆蟲蛋白質用真空冷凍干燥機在溫度-30~40°C、時間20h干燥制備 成凍干蛋白粉。
[0033] 實施例3: (1) 將1000 g壁虎蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對膨化裝置內 充入二氧化碳氣體并加壓至0. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，壁虎蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態二氧化碳、