腦膜炎球菌血清組x偶聯物的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2012年5月22日提交的美國臨時申請號61/650,025 ;2012年9月 9日提交的美國臨時申請號61/698,677 ;以及2013年3月15日提交的美國臨時申請號 61/799,528的權益。前述的申請通過引用全文納入本文用于所有目的。
技術領域
[0003] 本發明涉及細菌莢膜糖的領域，具體是腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)血清組X莢膜多糖。該多糖可與載體偶聯以形成偶聯物。多糖和偶聯物可 用于免疫，尤其是在水性制劑中。
【背景技術】
[0004] 在抵御有莢膜細菌的疫苗中使用細菌的莢膜糖已有多年歷史。然而，由于糖是T 非依賴性抗原，它們的免疫原性較弱。與載體偶聯可將T非依賴性抗原轉化成T依賴性抗 原，從而增強記憶反應并能發展出保護性免疫。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶聯物，原型 偶聯疫苗針對流感嗜血菌（Haemophilus influenzae) ( 'Hib'）[例如見參考文獻86的第 14 章]。
[0005] 基于生物體的莢膜多糖，已經鑒定了腦膜炎奈瑟球菌的12種血清組（A、B、C、H、 I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。組A是非洲撒哈拉沙漠以南地區流行疾病中最常涉及的病原 體。血清組B和C是美國和大多數發達國家中的大多數病例的病因。血清組W135和Y是 美國和發達國家中剩余病例的病因。多年來已知來自血清組A、C、Y和W135的莢膜多糖的 四價疫苗[1，2]。雖然在兒童和成人中有效，但是因為多糖是誘導不能加強的弱免疫應答的 非T細胞依賴性抗原，其誘導的免疫應答弱且保護持續時間短，并且不能用于嬰兒[例如參 考文獻3]。該疫苗中的多糖不是偶聯的[4]。針對血清組C的偶聯疫苗已被批準用于人， 并且其包括Menjugate?[5]、Meningitec?和NeisVac-C ?。來自血清組A+C的偶聯物的混 合物是已知的[6-8]并且已經報道了來自血清組A+C+W135+Y的偶聯物的混合物[9-13]。
[0006] 自20世紀70年代以來，已知組X莢膜多糖的結構[14]并且該血清組與腦膜炎疾 病的多次爆發相關，例如，在非洲撒哈拉沙漠以南地區和中國[15，16]。在5歲以下的兒童 中，血清組X已知具有比血清組A明顯高的攻擊率。雖然多年來已經認識到需要針對這種 血清組的疫苗[17]，但是還沒有開發出有效的疫苗。已經提出了針對血清組X的偶聯物疫 苗[17,18]，但是這類偶聯物是否針對該血清組有免疫原性或保護性還是未知的。
[0007] 因此，仍然存在對血清組X莢膜多糖偶聯物的需求。此外，仍然存在對可用于針對 由該血清組造成的疾病的疫苗接種的偶聯物的需求。
[0008] 組X莢膜多糖的結構由通過不含0-乙酰基的α 1-4磷酸二酯鍵[19]結合在一起 的N-乙酰葡糖胺-4-磷酸殘基組成：- 4) -D-GlcpNAc- α - (1 - 0Ρ03 - }(圖1)。基于遇 它們的結構相似性，已經假定MenA和MenX莢膜多糖之間的生物合成關系[14]。MenA莢膜 多糖易于在水性溶液中發生明顯水解[20]。這種不穩定性被認為是由于涉及異頭位的磷酸 二酯連接和甘露糖胺2位中的N-乙酰基的存在而造成的，其可有助于磷酸單酯基團的離開
[21]。另一種可能性是N-乙酰甘露糖胺亞基的4位上的羥基與磷酸二酯基團相互作用通 過內部參與機制促進水解，如在6A型肺炎鏈球菌[22]和B型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae type b) [23]的莢膜多糖中所見。在MenX和MenA莢膜多糖的結構中的相似 性，尤其是它們共有的異頭磷酸二酯連接，表示在水性溶液中時，MenX多糖可能存在相似的 穩定性問題。MenA莢膜多糖在水溶液中的固有不穩定性表明當包含于疫苗（例如，在多糖 疫苗Mencevax?和偶聯物疫苗MenAfriVac ?、Menveo?和Nimenrix ?)中時，其通常以凍干 形式存在。雖然MenX莢膜多糖可以相似地以凍干形式存在以改善其穩定性，但是水性制劑 是更為方便的。在水性制劑中含有MenA莢膜多糖偶聯物的僅有的疫苗是Menactra?，但是 這種疫苗需要在低溫下儲存。這種低溫儲存是昂貴的并且在MenA和MenX時常爆發的許多 國家（例如，非洲撒哈拉沙漠以南地區）中存在實際困難。
[0009] 因此，存在對血清組X莢膜多糖及其偶聯物的水性制劑的需求，尤其是無需冷藏 的水性制劑。
[0010] 針對MenX的疫苗的開發需要用于多糖定量的方法，其可用作加工中測試和/或用 于最終疫苗的表征。在MenX莢膜多糖中磷酸基團的存在表示可通過測量總磷含量的比色 法來定量多糖[24]。然而，這種方法缺少選擇性并且因此不適于某些加工中應用，例如，磷 酸鹽緩沖液中或在含磷酸鹽雜質存在下的多糖分析。更有選擇性的方法是NMR，其已經被 提出用于MenX多糖定量[25]。然而，這種方法要求純的樣品和大量的材料。參考文獻26 證明了替代的方法，其中通過HPAEC-PAD來對MenX多糖進行定量，其比NMR更靈敏并且比 測量磷酸含量更有選擇性。參考文獻26的作者通過水解樣品生成葡糖胺，并且將釋放的葡 糖胺的量與衍生自N-乙酰基-葡糖胺-6-磷酸的定量標準物的校準曲線做比較來對MenX 多糖進行定量。然而，由于污染，可能存在葡糖胺，其產生不精確的結果。因此，存在對測量 MenX多糖的替代或改良方法，并且尤其是對MenX更有選擇性的方法的需求。
【發明內容】
[0011] 本發明部分基于用于將血清組X莢膜多糖偶聯至載體分子的方法。本發明的發明 人已經發現，所得的偶聯物是免疫原性的并且能夠誘導殺菌抗體應答。因此，血清組X偶聯 物可用于免疫原性組合物，并且尤其是用于疫苗。本發明的發明人已經發現，能夠將血清組 X莢膜多糖抗原，例如，血清組X偶聯物與其他抗原結合而不失去針對血清組X的免疫應答。 具體地，血清組X偶聯物可與其他偶聯物組合，例如包含其他細菌莢膜糖抗原的偶聯物。血 清組X偶聯物特別適于與包含來自其他腦膜炎奈瑟球菌血清組（例如，血清組A、C、W135和 Y)的莢膜糖抗原的偶聯物組合。在這些組合中，不僅血清組X偶聯物保持其免疫原性，血清 組A、C、W135和/或Y偶聯物也保持其免疫原性。此外，本發明的發明人也已經發現盡管 其與血清組A莢膜多糖在結構上相似，來自血清組X的莢膜多糖令人驚訝地在溶液中穩定。 因此，血清組X莢膜多糖及其偶聯物特別適用于水性制劑。
[0012] 在第一方面，本發明提供了腦膜炎奈瑟球菌血清組X莢膜多糖和載體分子的偶聯 物。本發明的發明人已經發現可使用下述的本發明的第二方面的第一實施方式的過程來制 備血清組X莢膜多糖和載體分子的特別穩定的偶聯物。例如，在37°C下28天后，偶聯物可 含有低于50%的游離糖。可如下文穩定性研宄（2)所述測定游離的糖％。因此，在本發明 的第一方面內，本發明提供了在37°C下28天后包含低于50%的游離的糖的血清組X莢膜 多糖和載體分子的偶聯物。偶聯物可具體包含低于25%的游離的糖，尤其是低于20%的游 離的糖并且更具體地低于15%的游離的糖，例如，約10%的游離的糖。
[0013] 在第二方面，本發明提供了用于制備血清組X莢膜多糖和載體分子的偶聯物的方 法，尤其是下述第一、第二和第三實施方式的方法。第二方面也提供了下述的第四實施方式 的方法。通常通過這些方法之一得到或可得到本發明的第一方面的偶聯物。然而，可通過 任意合適的方法替代性地制備第一方面的偶聯物。當通過這些其他方法之一制備本發明的 偶聯物時，該方法通常不包括以下步驟中的一個或兩個：a)將多糖與接頭偶聯，以形成多 糖-接頭中間體，其中接頭的游離末端是酯基團，尤其是其中偶聯間接地發生，即采用額外 的接頭，該接頭用于在偶聯到接頭上之前對多糖衍