一種蘋果多酚乙醇提取物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蘋果多酚，特別涉及蘋果多酚乙醇提取物的制備方法及其在制備降血 糖藥物或食品中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著生活水平的提高和老齡人口的急劇增加，慢性病已成為城鄉居民死亡的主要 原因。目前，我國居民成人超重率為22.8%，肥胖率為7. 1%，血脂異常、高血壓、糖尿病 (diabetesmellitus，DM)患病率分別為18. 6%、18. 8%、2. 6%，特別是近20年內DM患者 數增加了近3倍。胰島0細胞能合成、儲存和釋放胰島素，胰島素在調節物質代謝穩態中 具有重要的生理意義。胰島e細胞損傷可造成胰島素分泌障礙，引起糖、脂、蛋白質代謝的 紊亂，最終導致DM。胰島素的絕對或相對不足或胰島素抵抗是DM的主要病理基礎，若胰島 素的功能受阻、分泌不足，或兩者同時存在缺陷，均可導致血糖增高。因此，對胰島細胞保護 的研宄，具有重要的理論和實踐意義。胰島素是預防DM及其并發癥的最佳選擇。
【發明內容】
[0003] 本發明目的在于提供一種用于制備降血糖藥物或食品的蘋果多酚乙醇提取物，研 宄發現本發明提供的蘋果多酚乙醇提取物對H2O2損傷的胰島細胞的保護作用，從而為糖尿 病患者的治療提供更科學有效的活性物質。
[0004] 本發明提供了一種蘋果多酚乙醇提取物，按重量百分比計，所述蘋果多酚乙醇提 取物包含綠原酸（。111〇1'〇8611；[。3(^(1)0.8~1.5%，咖啡酸（。&打6；[。&(^(1&(^(1)1.0~ 1. 6 %，表兒茶素（epicatechin) 0? 3 ~0? 8 %，5_0_ 對香S醜査尼酸（5-0-p-coumaric acylquinicacid)3 ~4 %，4-0_ 對香豆酰奎尼酸（4-0-p-coumaricacylquinic acid) 5. 5 ~6. 5 %，對香S酸（p-coumaricacid) 0? 5 ~I. 0 %，l-0-咖啡醜査尼酸甲 醋（1-0-Caffeoylquinicacidmethylester)0.3 ~1.2%，4-0_ 對香豆酰奎尼酸甲醋 (4-0-p-coumaricacylquinicacidmethylester)0.3 ~0.9%，3_羥基根皮素-2'木糖 葡萄糖苷（3-Hydroxyphloretin-2' _xyloglucoside)3. 0 ~4. 0%，羥基根皮苷（3-hydroxy phloridzin) 1. 2 ~2. 0%，根皮素-2'木糖葡萄糖苷（phloretin_2'-xylglucoside) 15 ~ 18%，根皮素-2'木糖半乳糖苷（Phloretin_2'-xylogalactoside)2.0 ~3.0%，根皮苷 (phloridzin) 20~26%，根皮素（phloretin) 0? 2~0? 8%，此外還含有其他不明酷酸類成 分（30 ~38% )。
[0005] 本發明還提供了上述蘋果多酚乙醇提取物的制備方法，該制備方法包括以下步 驟：
[0006] 1)將6質量份數的蘋果多酚溶解分散于80-100質量份數的水中；
[0007] 2)將步驟1)得到的溶液通過大孔樹脂柱色譜層析，以0. 3~0. 7柱保留體積/小 時（BV/h)的流速上樣，相繼用水、以及體積比分別為30%、50%和90%的乙醇水溶液各洗 脫4~6柱保留體積（BV)，洗脫流速為1~1. 5柱保留體積/小時（BV/h)，獲得體積比為 50 %的乙醇水溶液的洗脫液；
[0008] 3)將所述體積比為50%的乙醇水溶液的洗脫液真空干燥至紅色粉末，即得到蘋 果多酚乙醇提取物。
[0009] 在根據本發明的一個實施方式中，步驟1)中所述的蘋果多酚是通過包括以下步 驟的方法制備的：將蘋果洗凈、切碎，并浸泡于濃度為0.Olg/ml的維生素C的水溶液中，破 碎后用體積比為60 %的乙醇水溶液60°C下浸提2h，每批提取兩次，合并提取液，真空濃縮 干燥，最后得蘋果多酚。
[0010] 在根據本發明的一個實施方式中，步驟2)中所述大孔樹脂為二苯乙烯類大孔樹 月旨，優選地選自HP20、D101或AB-8中的一種。
[0011] 在根據本發明的一個實施方式中，步驟3)中所述體積比為50%的乙醇水溶液的 洗脫液以60°C、真空度低于0. 09MPa的條件下減壓濃縮至糖度為25~35,然后噴霧干燥至 紅色粉末并過藥篩；優選地，所述藥篩為80~100目藥篩。
[0012] 本發明還提供了所述蘋果多酚乙醇提取物在制備提高胰島細胞活性和促進胰島 細胞增殖的藥物中的應用。
[0013] 進一步地，本發明還提供了所述蘋果多酚乙醇提取物在制備保護胰島細胞抵御氧 化損傷的藥物中的應用。
[0014] 進一步地，本發明還提供了所述蘋果多酚乙醇提取物在制備預防和/或治療糖尿 病的中的用途。
[0015] 另一方面，本發明還包括一種用于預防和/或治療糖尿病的藥物組合物，其包含 如上所述的蘋果多酚乙醇提取物。優選地，所述藥物組合物還包含藥學上上可接受的輔料 和/或其它預防和/或治療糖尿病的藥物。
[0016] 蘋果多酚組分具有調節血糖的作用，但是，尚無蘋果多酚乙醇提取物對胰島細胞 保護方面的作用機制的文獻報道。本發明的發明人發現蘋果多酚的體積比50%的乙醇水 溶液的提取物（AP-50)對H2O2損傷的胰島細胞的保護作用，尤其是對胰島0細胞具有保護 作用。對于多次給予鏈脲佐菌素（multiplelow-dosestreptozotocin,MLDS)誘導的糖尿 病模型，AP-50提取物可抑制小鼠體重增長，并有劑量依賴性。口服葡萄糖耐量實驗與口服 淀粉耐量實驗，表明AP-50提取物可以改善進餐后血糖，且具有劑量依賴性。AP-50提取物 對MLDS誘導的糖尿病小鼠有促進胰島素分泌的作用，且其作用明顯優于蘋果多酚。留取腎 臟HE染色，發現AP-50提取物對MLDS誘導的糖尿病小鼠的腎損傷有一定的保護作用。綜 上所述，本發明的蘋果多酚乙醇提取物可以通過抑制體重增加，保護胰島細胞，促進體內胰 島素分泌等方面發揮降血糖功效。
【附圖說明】
[0017] 圖1蘋果多酚的體積比為50 %的乙醇水溶液的提取物對胰島RIN-m5F0細胞的促 增殖作用的柱形圖。其中，注：表示與空白對照組相比，P〈〇.05;"**"表示與空白對照 組相比，P〈〇. 01。
[0018] 圖2A和圖2B是蘋果多酚的體積比為50%的乙醇水溶液的提取物對H2O2損傷胰 島RIN-m5F0細胞的保護作用的柱形圖。其中，與空白對照組比較，# :P〈0. 01，* :P〈0. 05。
[0019] 圖3A是本發明的蘋果多酚的體積比為50%的乙醇水溶液的提物物的蛋白相對含 量柱狀圖。
[0020] 圖 3B是Westernblotting分析H2O2損傷膜島RIN_m5F0 細胞后Akt、caspase_3 蛋白的表達情況。
[0021] 圖4是通過A0/EB染色觀察本發明的蘋果多酚的體積比為50%的乙醇水溶液的 提取物對細胞形態的影響。其中A為蘋果多酚的體積比為50%的乙醇水溶液的提取物 (50yg/ml)組；B為蘋果多酷的體積比為50%的乙醇水溶液的提取物（10yg/ml)組；C為 蘋果多酚的體積比為50%的乙醇水溶液的提物（2yg/ml)組；D為蘋果多酚的體積比為 50%的乙醇水溶液的提取物（0. 4yg/ml)組；E為陰性對照組；F為空白對照組。
[0022] 圖5是對本發明的蘋果多酚的體積比為50%的乙醇水溶液的提取物的成分進行 分析的HPLC圖譜。
[0023] 圖6為蘋果多酚及其提取物對糖尿病小鼠模型體重的影響。
[0024] 圖7為蘋果多酚及其提取物對糖尿病小鼠空腹血糖的影響。
[0025] 圖8為蘋果多酚及其提取物對糖尿病小鼠口服糖耐量的影響。
[0026] 圖9為蘋果多酚及其提取物對糖尿病小鼠口服淀粉耐量的影響。
[0027] 圖10為AP-50提取物對糖尿病小鼠胰島素的影響。
[0028] 圖11為AP-50提取物對糖尿病小鼠腎臟指數變化的影響。
[0029] 圖12為AP-50提取物對糖尿病小鼠腎臟病理變化的影響。
【具體實施方式】
[0030] 為了更好地說明本發明的技術方案，現結合附圖和實施例進一步闡述本發明，應 當理解，本發明的具體實施例僅是用于說明目的，而非對本發明的限制。
[0031] 實施例1蘋果多酚的提取方法
[0032] 本發明使用的蘋果多酚購自天津市尖峰天然產物研宄開發有限公司（批號： 1310019-14,多酚，81.8% ;綠原酸，15.3% ;原花青素B2,6. 36% ;根皮苷，5. 12% )。蘋