用于將生物活性物質引入腦的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及研發一種用于將合成的和天然的生物活性的且藥用的物質基于所述 物質和自由基性質的膜活性產物和/或該產物的源與鼻腔的神經和血管結構的交互作用 從鼻腔直接供給到腦中的醫藥生物方法。
【背景技術】
[0002] 環境是多種生物活性分子的源，所述生物活性分子隨著食物或者從空氣環境進入 到生物體中。生物活性分子的其它重要的源是生物體的內部源，這樣的內部的源如是血液 和間質液。為了到達器官結構或者組織，生物活性物質必須從外部的和內部的環境中穿過 生物膜，例如穿過腦的膜結構。
[0003] 生物體的外部和內部環境的大量生物活性分子是有用的并且對于器官和組織包 括腦的正常地起作用是必要的，生物活性分子尤其是包括大多數藥物以及許多生物化合 物一一新陳代謝的產物，所述產物在生物體中在代謝過程中形成。
[0004] 同時，將通常已知的和新的藥物、生物技術產品供給到腦中以及用于治療中樞 神經系統（ZNS)、尤其是腦的一系列代謝物的治療應用，是嚴重的問題。在過去十年的科 學和專利文獻中描述了將一些中樞性地作用的藥物從鼻腔中供給到腦中的方法。（Ming Ming ffen(2011)http://www. discoverymedicine. com/Ming-mingffen/2011/06/13/ οIfactor y-targeting-through-intranasal-delivery-of-biopharmaceutical-drug s-t〇-the-brain-current-development/ ；Costantino H. R. et al. (2007). Intranasal delivery-Physicochemical and therapeutic aspects. International Journal of Pharmaceutics 337:1-24)。
[0005] 在Ming Ming Wen和Costantino等的工作中，描述了用于將藥用物質從鼻腔中供 給到腦中的已知的措施。尤其包括：應用粘膜附著性輔助劑，所述輔助劑增強穿過膜的滲 透，這些輔助劑如是脂質體、納米顆粒，并且甚至包括應用血管收縮劑，這沒有充分的科學 依據。
[0006] 多種所描述的方法雖然可使一些小分子透入到腦中，然而所述方法對于寬范圍的 藥用物質而言不是通用的方法。
[0007] 顯而易見的已知的解決方案為用于治療和免疫的將藥用物質經鼻運輸到外周血 液中并且到腦中的方法（根據專利EP 1 031 347 BI)。作者確認，迄今為止所使用的經鼻 運輸的方法不能夠確保便捷且可接受地將藥物活性物質運輸穿過鼻腔的膜的令人信服的 原理。
[0008] 作者發現所述問題的解決方案的一個重要的要素是存在細胞因子或者其源的制 藥學配方。然而作者所使用的方法僅是用于將藥物在鼻部供給到外周血液循環和/或腦中 的一種可行的途徑和一種免疫接種的手段，并且僅能夠用作為進一步改進藥物的鼻部供給 以用于治療腦部疾病的藥理和技術平臺。
[0009] 所描述的方法的主要不足之處在于藥物的準備和應用的復雜性以及對于水溶性 的化合物的特定的限制。該方法的另一個不足之處在于藥用組合物的復雜的準備。
[0010] 之前已經發現：自由基物質或者其副產物、過氧化氫（H2O2)或者·ΝΟ活性產物、例 如L-精氨酸能夠在特定的條件下確保提高鼻腔的神經和血管的膜結構的可透過性并且有 助于在透過時生物活性物質進入腦中（專利號DE 102 48 601，歐洲專利號010692)。
[0011] 至今已經大量地討論了用于解決技術問題的構想，因此也在文獻（Goldstein N. , et al. 2012, Blood-Brain Barrier Unlocked. Biochemistry(Moscow), Vol. 77, No. 5, pp. 419-424)中討論。在該文獻中，為了確定生物活性物質多巴胺在與微摩爾的過氧化氫一 起同時在鼻部導入時引入到腦中的有效性，執行借助于氚標記的多巴胺（DA)的試驗。通常 已知的是，為此多巴胺不能夠在常見條件下滲入到腦中并且在那里觸發明顯的效果。
[0012] 為了證實多巴胺在腦結構中的具體的生物活性，執行借助于同位素產品[3H]-多 巴胺并且借助于抗精神病藥氟哌啶醇的動物實驗的研宄。在此通常已知的是，多巴胺不能 夠在常見條件下滲入到腦中并且在那里觸發明顯的生理或者治療效果。為了證實多巴胺在 腦結構中的具體的生理活性，執行借助于同位素產品[ 3H]-多巴胺并且借助于抗精神病藥 氟哌啶醇的動物實驗的研宄。
[0013] 在制備用氚標記的[3H]-多巴胺時，使用多巴胺鹽酸制劑中的氫相對于氚的高溫 固相催化的同位素置換反應。所產生的制劑[ 3H]_DA在色譜柱Kromasil C18(8X 150mm)中 在乙腈的水溶液的濃度梯度中在存在0. 1%的七氟丁酸的情況下被滌出。所述制劑的定量 分析通過HPLC在使用DA標準（<〈Sigma/Aldrich>>)的條件下執行。均勾標記的DA的具體 的放射性為20Ci/Mol。所述制劑的儲備溶液包含體活度為0. 75mCi/ml的KT2M的[3H]-多 巴胺。
[0014] 在準備鼻部導入多巴胺溶液時，制備[3H]-DA_溶液（濃度為4Χ10- 2Μ，體活度為 O. 75mCi/ml)與穩定的過氧化氫的等滲溶液的混合物（〈〈Sigma/Aldrich>>)。鼻部導入的 溶液中的多巴胺和H 2O2的終濃度相應為KT2M和10_5M。在實驗動物組中導入[ 3H]-DA-溶 液和H2O2-溶液的混合物。控制組中的動物接受[ 3H]-DA+0. 9% NaCl的混合物。
[0015] 在準備老鼠的生物材料時去除腦，下丘腦和紋狀體的兩個部分被切除并且被置于 冷的襯墊上（+4°C)，其中所述老鼠在鼻部導入包含[ 3H]-DA的溶液三分鐘后被處死。所取 出的腦結構在35s至40s內被稱量，在液氮中冷凍并且安置到艾本德試管中。冷凍的樣品 凍干48小時長并且緊接著通過200 μ 1 0.1 M的此104溶液萃取。隨后將樣品在15分鐘內 在1000 Og中離心分離并且將上清液用于確定[ 3H-DA]和[3H-DOPAC]。
[0016] 因為樣品中的DA和DOPAC的終濃度對于借助于UV檢測結合血液的血漿的峰值來 確定該物質的放射性衍生物是不足的，所以由于該原因在色譜分離之前分別將10 μ g未標 記的多巴胺標準品和其代謝產物3, 4-二羥苯乙酸（DOPAC)添加到組織萃取液中。0.1 M的 HClO4中的萃取液的色譜分析在色譜柱Kromasil C18-5 μ m(4X 150mm)中在20°C下借助于 用〇.1%的七氟丁酸中的乙腈（4%至24%)的梯度洗脫來執行。同時對25411111和22〇11111的 波長的檢測在貝克曼分光光度計（Modell 165, Altex)上執行，樣品體積為100 μ 1。實驗組 和控制組的每個動物的、已分開地添加有[3H]-DA和[3H]-D0PAC的腦萃取物的餾分，借助于 液體閃爍計數器來量性分析。
[0017] 在圖1上示出包含多巴胺和DOPAC的萃取溶液、下丘腦以及紋狀體萃取物的典型 的色譜圖。
[0018] 圖1.鼠腦的下丘腦和紋狀體的色譜分析的萃取物餾分中的[3H]-DA和[ 3H]-DOPAC 的放射性。
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