用于抗原遞送的方法
【專利說明】用于抗原遞送的方法 發明領域
[0001] 本發明涉及用于抗原和/或生物活性分子遞送的新方法。
[0002] 發明背景 傳統地，疫苗基于身體對抗殺死或減活病原體產生抗體的原理。最近，開始了對基于 注射病原體的特別組分而非注射整個病原體本身開發亞單位疫苗的研究，以改善生物安全 性。亞單位疫苗包括病原體編碼的肽或蛋白性質的抗原。為了使這些肽和蛋白容易被抗原 呈遞細胞（APC)吞入，將抗原裝入納米或微米-大小顆粒。這些疫苗類型被稱為顆粒疫苗 (De Temmerman 等，2011) 〇
[0003] 正在進行對用作顆粒疫苗的多個抗原遞送方法的研究。乳劑、脂質體、免疫刺激劑 復合物、病毒樣顆粒、金、二氧化硅顆粒和基于聚合物的顆粒被用于此目的。基于聚合物的 顆粒可基于生物可降解的化合物，例如聚（D，L-乳酸）（PLA)和聚（D，L-乳酸-乙醇酸共聚 物）（PLGA)，或非-生物可降解的化合物，例如聚苯乙烯。疊層膠囊、殼聚糖顆粒、微米-和 納米凝膠尤其為基于聚合物的抗原遞送方法。
[0004] 上述所有遞送方法的共同特點為增加抗原的大小以使其容易被APC吞入（Xiang 等，2006)。顆粒疫苗的另一個性質為減緩抗原細胞外或吞入后細胞內的酶降解，以延長抗 原停留在所述環境中的時期，從而增強APC將這些抗原呈遞給T細胞的能力。
[0005] 與抗原遞送中使用的那些相似的方法還正用在控制藥物釋放系統中。存在其中經 由口服或鼻途徑使用微粒藥物釋放系統的應用。存在許多對從基于聚合物的微粒控制釋放 生長因子的研究（Balmayor等，2011)。
[0006] 抗原被APC有效吞入在抗體產生過程中至關總要。為了達到這一目的，將 短肽抗原（半抗原）與較大的載體蛋白交聯。為此最經常使用的載體蛋白為匙孔 i或血藍蛋白（KLH)和牛血清白蛋白（BSA)蛋白。最優選的載體蛋白KLH為從 cre/w/aia分離的分子量350 kDa的蛋白。該蛋白有聚集傾向。KLH的可溶和聚集體形式 二者均顯示抗原性質。由于其大尺寸，在細菌中表達KLH蛋白或通過分子克隆方法融合半 抗原和KLH編碼序列并不實際。
[0007] 在上述抗原和/或藥物遞送系統中，脂質體和水凝膠降解相對較快。除此之外，月旨 質體還傾向于互相融合。因此，脂質體和水凝膠二者均具有短的儲存壽命。
[0008] 用于合成基于聚合物的微粒的方法（有機溶劑、高溫和凍融循環）可損傷抗原或 生物活性分子有效負載的結構和活性。
[0009] -般而言，與全-病原體疫苗相比亞單位疫苗產生較低的抗原產量。已經發展了 多個策略克服這一問題。第一個方法為用具有與APC膜融合傾向的分子（抗體、受體配體） 包覆微粒。這樣，微粒被APC吞入的頻率增加。另一個策略為用靶向特定APC受體的分子 (佐劑）包覆微粒，所述受體提高APC抗原呈遞能力。Toll樣受體（TLR)家族成員在結合其 配體時受激并且激活促進細胞抗原呈遞能力的途徑。為了刺激TLR家族成員，微粒用CpG、 聚（I:C)、MPL、3M-019和鞭毛蛋白配體覆蓋。
[0010] 包含CARD的細胞凋亡-相關斑點樣蛋白（ASC、PYCARD、TMSl)為在N-末端具有 PYD結構域和在C-末端具有CARD結構域的22 kDa接頭蛋白，其作用于NLRP3、NLRC4和 AIM2炎性小體復合物。ASC蛋白在炎癥和pyroptotic信號通路中胱天蛋白酶-1蛋白的激 活中發揮作用（Franchi等，2009)。炎性小體復合物被激活時在核周腔形成斑點結構（ASC 斑點）的為胞質蛋白（Miao等，2011)。
[0011] pyroptotic細胞死亡期間，一旦出現促炎刺激ASC蛋白形成直徑數微米的被稱 為pyroptosome的球狀超分子結構。據推測，pyroptosome通過寡聚體化ASC二聚體形成 (Fernandes-Alnemri 等，2007) 〇
[0012] NLRP3炎性小體（也包含ASC蛋白）可通過刺激例如胞外ATP、膜損傷毒素（尼日 利亞菌素）、溶酶體損傷、尿酸單鈉（MSU)和UV射線觸發。NLRP3炎性小體激活伴隨微米-大 小的斑點或pyroptosome結構合成。當ASC蛋白過表達時這樣的斑點結構也可在細胞內形 成，而無需任何其它刺激。ASC斑點可通過在低滲溶液中于37°C孵育純化的重組ASC蛋白 體外合成（Fernandes-Alnemri 等，2007)。
[0013] 在國際專利文獻W02009014863中，ASC蛋白和pyroptosome用于自身免疫疾病的 診斷和治療。根據該發明，在巨噬細胞中早期炎癥反應期間出現凋亡和包含ASC二聚體和 胱天蛋白酶原-1的pyroptosome結構。胱天蛋白酶-1的激活依賴于pyroptosome的形成。 炎癥的狀態通過從巨噬細胞分離pyroptosome診斷。
[0014] 含有MF59佐劑的流感接種后，根據ASC敲除和野生型小鼠之間的數據比較，假定 ASC蛋白在觸發抗原特異性體液反應中發揮作用。然而，關于通過抗原肽與ASC蛋白或ASC 斑點結合完成抗原遞送沒有任何建議（Ellebedy等，2011)。
[0015] 發明簡述 本發明目標為提供使ASC斑點載體負載抗原和/或生物活性分子。
[0016] 本發明另一個目標為提供在抗原和/或生物活性分子至抗原呈遞細胞（APC)的遞 送中使用ASC斑點載體。
[0017] 本發明進一步的目標為減緩與ASC斑點載體一起被內吞或吞噬的抗原被細胞內 的酶降解，并且延長抗原停留在該環境中的時間從而提高APC向T細胞呈遞抗原的能力。
[0018] 本發明另一個目標為經由ASC斑點載體增加抗原和/或生物活性分子的大小以使 其容易被APC吞入。
[0019] 本發明又一個目標為增加 ASC斑點載體運載的抗原和/或生物活性分子的儲存壽 命。
[0020] 發明詳述 附圖中說明了所開發的完成本發明目標的抗原遞送方法，其中： 圖I - HiCherry-ASC斑點在HEK 293 FT細胞中的合成及其純化。HEK 293 FT細胞用 編碼mCherry-ASC融合蛋白的質粒轉染。A、B、C :合成mCherry-ASC斑點的HEK 293 FT細 胞。A :mCherry-ASC斑點（共聚焦顯微鏡）。B :亮視野顯微鏡下的細胞。C :圖IA和IB的 疊加。合成的mCherry-ASC斑點隨后從HEK 293 FT細胞純化。D :純化的mCherry-ASC斑 點（共聚焦顯微鏡）。E :亮視野顯微鏡下的斑點。F :圖ID和IE的疊加。
[0021] 圖2 -將mCherry-FGF2融合蛋白裝載到EGFP-ASC斑點。將編碼mCherry-FGF2 和EGFP-ASC融合蛋白的質粒轉染入HEK 293 FT細胞，觀察到mCherry-FGF2融合蛋白被裝 載到EGFP-ASC斑點。A :EGFP-ASC B :mCherry-FGF2 C :亮視野顯微鏡圖像D :圖2A、2B和 2C的疊加。
[0022] 圖3 -用與EGFP蛋白融合的肽經由疏水相互作用包覆mCherry-ASC斑點外殼。用 編碼mCherry-ASC和EGFP-X的質粒共轉染HEK 293 FT細胞。X為對于3A、3B、3C:〃stop〃 (EGFP-stop，SEQIDN0:2);3D、3E、3F :肽l(SEQIDN0:4);3G、3H、3I:肽2(SEQIDN0: 8);3J、3K、3L:肽3(SEQIDN0:9)。3A、3D、3G、3J:EGFP-X(X分別為〃stop"、肽l、肽2、 肽 3)。3B、3E、3H、3K :mCherry-ASC。3C、3F、3I、3L :EGFP-X (X :分別為〃stop"、肽 1、肽 2、 肽3)和mCherry-ASC蛋白的疊加。
[0023] 圖4 -疏水性肽應至少13個氨基酸長以包覆mCherry-ASC斑點的外殼。將編碼 EGFP-X的質粒共轉染HEK 293 FT細胞。X為對于4A、4B、4C:肽l_19aa(SEQIDN0:5); 4D、4E、4F:肽l_12aa(SEQIDN0:6);4G、4H、4I:肽l_8aa(SEQIDN0:7)。4A、4D、4G : EGFP-X。4B、4E、4H:mCherry-ASC。4C、4F、4I:EGFP-X (X 分別為肽 l_19aa、肽 l_12aa、肽 l_8aa)和mCherry-ASC蛋白的疊加。
[0024] 圖5 -與EGFP融合的肽的親水性圖。水平線下面的下降柱代表疏水氨基酸，而上 升柱代表親水氨基酸。5A:肽 I (SEQ ID NO: 4)，5B:肽 2 (SEQ ID NO: 8)，5C:肽 3 (SEQ ID NO: 9)，5D:肽 l_19aa (SEQ ID NO: 5)，5E:肽 l_12aa (SEQ ID NO: 6)，5F:肽 l_8aa (SEQ ID NO: 7)。
[0025] 圖6 - THP-I細胞所吞入的mCherry-ASC斑點的膜封閉狀態及其在細胞內的緩慢 降解。具有巨噬細胞特征的PMA分化的THP-I EGFP-ASC穩定細胞系用純化的mCherry-ASC 斑點孵育2小時。在非生理環境中大量延時成像過程中，細胞喪失其膜完整性并顯示凋 亡特征。由于細胞凋亡所致，包含mCherry-ASC斑點載體的吞噬溶酶體細胞器的膜結構 松弛并可清楚地觀察到。除此之外，吞噬溶酶體內部但mCherry-ASC斑點外部的空間充 滿mCherry信號（6G-L: t=600 s至t=1100 s)。這顯示mCherry-ASC斑點以緩慢的步伐 胞內降解。細胞在共聚焦顯微鏡下以100秒時間間隔成像（6A-6L)。左：EGFP-ASC。中： mCherry-ASC。右：明視野。
[0026] 圖7 -管狀小泡從包含mCherry-ASC斑點的吞噬溶酶體擠壓斷離。具有巨噬細 胞特征的PM分化的THP-I EGFP-ASC穩定細胞系用純化的mCherry-ASC