miR-216在制備促進成骨分化的藥物中的用圖
【技術領域】
[0001] 本領域涉及再生醫學領域，具體而言涉及miRNA在制備促進成骨分化的藥物中的 用途。
【背景技術】
[0002] 人間充質干細胞（hMSCs)具有自我更新和多譜系分化潛能，在適當條件下能夠分 化為骨、軟骨、脂肪和肌組織（Prockop，DJ，1997 ;Phinney，DG，2007 ;PUtenger，MF 等人， 1999和Fink，T等人，2011)。研究者首先從骨髓中分離出MSC (BMSCs),并證明了其多系分 化的能力。BMSCs向成骨細胞分化是機體普遍存在的生理過程。在生理條件下，骨組織呈 現成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收的動態平衡。一旦各種原因導致這種動態平衡破 壞，如成骨分化能力降低時，就會引起骨質疏松、鎖骨顱骨發育不全、股骨頭壞死、關節退行 性變、脊柱側彎等骨相關疾病。因此，揭示間充質干細胞成骨的調控機制具有極其重要的臨 床應用價值。
[0003] 由于受來源的限制以及取樣困難，BMSC的研究和應用發展較慢。后來的研究發現， 除骨髓外，MSC還廣泛存在于脂肪、皮膚、滑液、脫落的牙齒、羊水和胎盤等多種組織器官中 (Prockop，DJ，1997)。研究證明，與骨髓來源的MSC相似，人脂肪組織來源的MSC (hAMSCs) 具有跨系甚至跨胚層的多向分化潛能，在體內外可分化成多種細胞類型，如成骨細胞、軟骨 細胞、脂肪細胞、肌細胞、內皮細胞、神經膠質細胞等。此外與BMSC相比，hAMSC s具有原料充 足，取材方便，體外分離擴增方法簡單易行等優點，因此備受研究者青睞。目前MMSCs已經 成為研究MSC自我更新和分化的最佳細胞模型和最有發展潛力的組織工程種子細胞。
[0004] MicroRNAs UiRNAs)是一類高度保守的非編碼小RNA分子，能夠在轉錄或轉錄 后水平調控靶基因表達（Ambros，V，2004 ;Bartel，DP，2004)。最近，越來越多的證據表明 miRNAs能夠調控細胞分化和命運決定（Ivey, KN and D Srivastava，2010)。目前，miR-125、 miR-133、miR-135、miR-138、miR-181、miR-206、miR-9、miR-27、miR_196a、miR-214、 miR-764-5p、miR-2861、miR-3960、miR-642a-3p、miR-141/200a 和 miR-17-5p ~92/ miR-106a等許多miRNAs已經被證實參與成骨分化的調控。miR-214轉基因小鼠表現出明 顯的成骨能力降低（Wang，X，2013)。這些研究結果提示，HiiRNA s在MSC的成骨分化調控中 可能扮演了非常重要的角色。
【發明內容】
[0005] 根據一些【具體實施方式】，本發明提供miR-216在制備促進成骨分化的藥物中的用 途。
[0006] 在一些【具體實施方式】中，miR-216促進人脂肪組織來源的間充質干細胞向成骨分 化。
[0007] 在一些【具體實施方式】中，miR-216的序列如SEQ ID No. 1所示。SEQ ID No. 1為 UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA，其登錄號為 miRbase Accession number MIMAT0000273。
[0008] 在一些【具體實施方式】中，通過轉染試劑提供miR-216 ;轉染試劑優選為脂質體。在 一些【具體實施方式】中，轉染試劑是Lipofectamine2000。
[0009] 在一些【具體實施方式】中，miR-216的轉染濃度為100nmol/L。
【附圖說明】
[0010] 圖I :hAMSCs經成骨誘導培養基誘導后3天的ALP染色。
[0011] 圖2 :hAMSCs經成骨誘導培養基誘導后12天的茜素紅染色。
[0012] 圖3A :轉染NC對照后，hAMSCs的ALP染色。
[0013] 圖 3B :轉染 miR-216a 后，hAMSCs 的 ALP 染色。
[0014] 圖4A :轉染NC對照后，hAMSCs的茜素紅染色。
[0015] 圖4B :轉染miR-216a后，hAMSCs的茜素紅染色。
[0016] 圖5 :成骨誘導后堿性磷酸酶的活性。hAMSCs :未經轉染的hAMSCs ;NC :轉染有NC 對照的、經過成骨誘導的hAMSCs ;miR-216a :轉染有miR-216a的、經過成骨誘導的hAMSCs。
【具體實施方式】
[0017] 以下提供了本發明實施方式中所使用的具體材料及其來源。但是，應當理解的是， 這些僅僅是示例性的，并不意圖限制本發明，與如下組織、細胞、試劑和儀器的類型、型號、 品質、性質或功能相同或相似的材料均可以用于實施本發明。
[0018] 實施例1 :成人脂肪源間充質干細胞的分離和鑒定
[0019] 1.成人脂肪組織取自吸脂手術患者（中國醫學科學院整形醫院)，與自愿捐獻者簽 訂知情同意書，捐獻者均為25-35歲的健康女性。
[0020] 2.從脂肪組織中分離hAMSCs的方法簡述如下：
[0021] 吸脂術采集出來的脂肪組織用D-Hanks洗去血細胞和麻醉藥，0. 2g/100mlII型膠 原酶(購自：美國Life Technologies公司）消化Ih,之后用D-Hanks洗漆2遍以除去膠原 酶。
[0022] 離心收集細胞，細胞以2X106/ml的密度接種于含58% (v/v)DMEM/F12+40% (v/ v)MCDB-201、2% (v/v)胎牛血清、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF、1X 胰島素-轉鐵蛋白-亞 硒酸（ITS)UX亞油酸-牛血清白蛋白、50μΜ beta-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、100μ g/ ml青霉素和lOOU/ml硫酸鏈霉素的干細胞培養液，37°C、5%C02、95%濕度的培養箱培養。
[0023] 兩天后換液，棄去未貼壁的細胞，以后每3天半量換液。
[0024] 當細胞達70%~80%匯合時，0· 25g/100ml胰酶（Gibco)常規消化，細胞按照1 :3 進行傳代。
[0025] 3. hAMSCs 的表型：
[0026] 收集第三代細胞，PBS洗3次；
[0027] 加 0. 1%皂素室溫破膜1小時，PBA洗3次(若檢測細胞內抗原，則進行本步驟；若 檢測細胞表面抗原，則直接進行下一步）；
[0028] 加一抗（CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD106、HLA-DR、FLK-I 單抗，購自：BD 公 司），4°C孵育30分鐘；
[0029] 加 PBS洗3次，加 FITC標記二抗(兔抗鼠，購自中杉金橋生物技術有限公司），4°C 孵育30分鐘；
[0030] 加 PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，300ul PBS重懸；
[0031] 上流式細胞儀（品牌、型號）檢測細胞。經鑒定，細胞呈現典型的AMSC表型：
[0032] CD29+、CD44+、CD105+、FLK-Γ ;
[0033] CD31' CD34' CD106' HLA-、DR'
[0034] 實施例2 :miRNAs的轉染
[0035] 1.試劑：
[0036] (1)轉染試劑為 Lipofectamine2000 (Invitrogen);
[0037] (2)待轉染的 HiiRNAs :
[0038] miR-216 粉末為美國 Life Technologies 公司合成；
[0039] 采用公知技術合成與miR-216長度相似的無關序列（SEQ ID No. 2 : UUCUUCGAACGUGUCACGUTT)作為 NC 對照。
[0040] 2.待轉染的HIiRNAs儲備液配置：
[0041] 將裝有待轉染的HiiRNAs的管低速離心5min，按照Lipofectamine2000 (Invitrogen)說明書加入Opti-MEM溶解miRNA s，震蕩并瞬時離心配成20 μ M的儲備液。
[0042] 3.細胞準備：
[0043] 取第3代對數生長期、70%_80%匯合的hAMSCs進行轉染。
[0044] 4.轉染過程：
[0045] 用Opti-MEM分別稀釋待轉染的HiiRNAs和Lipofectamine2000,輕輕混勻后室溫放 置 5min ;
[0046] 將Lipofectamine2000稀釋液緩慢逐滴加入待轉染的miRNAs稀釋液中，輕輕混勻 獲得miRNA s和Lipofectamine2000混合液，室溫孵育20min ;
[0047] 從培養箱取出待轉染細胞，吸出培養液，用DPBS液(杜氏磷酸緩沖液)洗3遍，吸凈 洗液后每孔加入I. 5ml Opti-MEM ;
[0048] 將孵育好的miRNAs-Lipofectamine2000混合液緩慢逐滴入培養皿中.轉染量： HiiRNAs