一種轉移因子的制備方法及其注射劑的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制藥領域，具體地指一種轉移因子的制備方法及其注射劑的制備 方法。
【背景技術】
[0002] 轉移因子Transfer Factor (TF)，又稱傳輸因子，由具有細胞性免疫功能的淋巴細 胞產生，通過從凍融致敏的T細胞獲得的一種可透析的因子。能加強動物的免疫力，可以將 延遲過敏反應能力從一個個體（包括人和動物）轉移到另一個體，它們運送父淋巴細胞的 抗原特異細胞性免疫（遲發性過敏反應）到未暴露或原生的淋巴細胞。轉移因子攜帶有致 敏淋巴細胞的特異性免疫信息，能夠將特異性免疫信息遞呈給受體淋巴細胞，使受體無活 性的淋巴細胞轉變為特異性致敏淋巴細胞，從而激發受體細胞介導的免疫反應。轉移因子 具有廣泛的免疫學調節活性，一方面可誘導免疫細胞活化，增強機體非特異性免疫能力。另 一方面能夠將特異性免疫能力傳遞到其他動物，激發動物產生特異性免疫。
[0003] 由于其特定的作用，轉移因子臨床用于治療某些抗生素難以控制的病毒性或霉菌 性細胞內感染（如帶狀皰瘆，流行性乙型腦炎，白色念珠菌感染，病毒性心肌炎等）；對惡 性腫瘤可作為輔助治療劑（主要用于肺癌，鼻咽癌，乳腺癌，骨肉瘤等）；免疫缺陷病（如濕 瘆，血小板減少，多次感染綜合癥及慢性皮膚粘膜真菌病有較好的療效）。目前，已公開的 關于轉移因子注射劑的制備工藝中，通常包括以下方法：（1)用絞肉機或勻漿器將豬脾（牛 脾）勻漿，凍融，或超聲以破碎細胞；（2)離心；（3)離心液經10000分子量左右的超濾膜超 濾的轉移因子；(4)根據轉移因子的含量加注射用水配制注射制劑。
[0004] 中國專利申請"一種從牛脾臟中提取轉移因子的方法"（專利【申請號】 200810154335. 3)公開生產方法：將冷凍牛脾臟破碎、絮凝、透析、過濾除菌，制成含有轉移 因子的原液；"一種豬脾轉移因子注射液的制備方法"（專利【申請號】201310136476. 3)公 開豬脾轉移因子注射液的制備方法：將檢驗合格后的豬脾臟進行清洗、勻漿、甲醛滅活、凍 融破碎，經過濾、超濾后獲得原液，加入注射用水得到注射液；"一種豬脾轉移因子注射液 的生產方法"（專利【申請號】201110126248.9)中使用勻漿、低溫超聲破碎、離心、超濾工藝 提取轉移因子；"一種轉移因子溶液及其制備方法"（專利【申請號】201410306339.4)中將 豬脾進行清洗、勻漿、反復凍融、調節PH、過濾、超濾后得到轉移因子溶液；"一種轉移因子 的制備方法"（專利【申請號】201310640313.9)將新鮮雞脾進行清洗、勻漿、凍融破碎，經 離心加壓抽濾、超濾后獲得轉移因子溶液；"一種豬脾轉移因子制備方法"（專利【申請號】 201310755932. 2)包括組織絞碎、均質破碎、微濾、超濾等步驟，采用高壓均質機快速破碎細 胞。
[0005] 上述的工藝方法僅用凍融后離心，一方面不能充分有效的去除各類雜蛋白，這樣 使得產品容易引起過敏反應，不能有效去除各類動物源性病毒，使制劑存在病毒污染和異 常毒性不合格的風險；另一方面就是現有的制備方法均使用微濾膜、超濾膜進行過濾，濾膜 負荷大，壽命短，成本高，限制了醫學上的進一步使用。滅活過程中采用加入甲醛或進行升 溫處理，甲醛為致癌物，殘留的游離甲醛注入人體后產生制激性反應；升溫則易使轉移因子 的活性降低而影響使用效果。注射液中氨基酸、小肽類物質易發生聚合為大分子物質而析 出致使制劑不穩定，也易引起相關的副作用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的就是要解決上述【背景技術】的不足，提供一種轉移因子的制備方法及 其注射劑的制備方法，來減少轉移因子中的雜蛋白過敏源，有效去除各類動物源性病毒及 延長超濾膜的使用壽命。
[0007] 本發明的技術方案為：一種轉移因子的制備方法：
[0008] (1)預處理：將動物脾臟剝離其附著脂肪，用水洗凈；
[0009] (2)勻漿：加入動物脾臟重量1. 5~2倍的注射用水混合后，置于膠體磨內反復絞 磨4~6次，制成勻漿，移入-16°C下存放3天以上；
[0010] (3)反復凍融：將勻漿反復凍融3~5次；
[0011] (4)離心：將勻漿化凍后離心，取勻漿上清液；
[0012] (5)乙醇沉淀：在不斷攪拌下將勻漿上清液按1 : 2的體積比加入無水乙醇，在 〇~5°C靜置12小時以上，離心取上清液減壓真空濃縮至原體積的1/5~1/10,回收乙醇；
[0013] (6) -次超濾：調節濃縮液pH值至6.0~7.0,分別經50K分子量和IOk超濾膜超 濾后得轉移因子一次溶液；
[0014] (7)病毒滅活：在轉移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白質量分 數為1~2%。，經60°C保溫10小時后，迅速將溫度降至20°C以下；
[0015] (8)二次超濾：經3K~5K分子量的超濾膜超濾后得轉移因子溶液。
[0016] 優選的，所述反復凍融步驟中將已凝固的勻漿取出置于33~37°C水浴，不斷攪拌 使其快速融化，待勻漿全部融為液態時，再放入低溫冷凍，如此反復3~5次。
[0017] 優選的，所述離心步驟中，將勻漿化凍后在4°C、轉速3000r/min下離心30分鐘，取 勻漿上清液。
[0018] 優選的，所述乙醇沉淀步驟中無水乙醇與勻漿混合物在4°C、轉速3000r/min下離 心30分鐘。
[0019] 優選的，所述乙醇沉淀步驟中減壓真空濃縮的真空度為-0. 03~-0. 08MPa。
[0020] 優選的，所述動物脾臟為豬脾或牛脾。
[0021] 本發明還提供一種轉移因子注射劑的制備方法，步驟為：測定所述轉移因子溶液 內多肽和核酸的含量，加入注射用水調節至每2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯 化鈉使溶液中氯化鈉的濃度為〇. 9g/ml，加入穩定劑吐溫-80至溶液中的吐溫-80質量濃度 為1~2%。，除菌過濾后無菌分裝即得轉移因子注射劑。
[0022] 本發明的優點為：
[0023] 1.采用傳統工藝中均未使用的乙醇沉淀法去除各類雜蛋白，能有效保證產品的安 全性，減少過敏源，提高安全性；同時經乙醇沉淀去除雜蛋白后可減少后續超濾膜超濾的負 荷，延長超濾膜的使用壽命，降低成本，使其在生物上有進一步的應用。
[0024] 2.采用乙醇沉淀法去除雜蛋白，以及先后通過50KD、10KD，3~5KD超濾膜多級超 濾，既能保證雜蛋白的徹底去除，又能有效地控制高分子量物質，制得產品高分子物質少于 I. 0%，遠遠低于國家標準規定的少于5. 0%，能更有效地保證產品質量，保證臨床安全性。
[0025] 3.制備方法中加入白蛋白保護劑后采用60°C，10小時能有效滅活病毒，再加上后 續的超濾工藝，能充分保證動物源性病毒的滅活，保證制劑產品的安全性。同時白蛋白作為 保護劑，能保證在較高溫條件下轉移因子的活性不會降低。制得產品活力按T細胞活性測 定法一脫E受體法測定均不低于30 %，遠遠高于國家標準規定的不低于10 %。
[0026] 4.將牛脾（或豬脾）勻漿液采用低溫反復凍融，能使細胞內外的有效物質充分釋 放，保證有效成分的充分提取。
[0027] 5.注射劑配料過程中加入吐溫-80作穩定劑，能有效得避免制劑在儲存過程中有 機物類氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等聚合為大分子物質析出，影響制劑的澄明度，保證產品 長時間儲存過程的穩定，同時降低過敏反應發生率。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0029] 實施例1
[0030] 轉移因子的制備方法，包括如下步驟，
[0031] (1)預處理：將豬脾剝離其附著脂肪，用飲用水清洗2次，再用純化水清洗3次；
[0032] (2)勻漿：加入豬脾重量1. 5倍的注射用水混合后，置于膠體磨內反復絞磨4次， 制成勻漿，移入-16°C下存放3天以上；
[0033] (3)反復凍融：將已凝固的勻漿取出放入33°C的水浴中，不斷攪拌使其快速融化， 待勻漿全部融為液態時，再放入低溫冷庫內冷凍，如此反復3次；
[0034] (4)離心：將勻漿化凍后在4°C、轉速3000r/min下離心30分鐘，取勻漿上清液；
[0035] (5)乙醇沉淀：在不斷攪拌下將勻漿上清液按1 : 2的體積比加入無水乙醇，在 5°C靜置12小時以上，4°C、轉速3000r/min下離心30分鐘，取上清液在-0. 03MPa真空度下 減壓真空濃縮至原體積的1/5,回收乙醇；
[0036] (6) -次超濾：調節濃縮液pH值至6. 0,分別經50K分子量和IOk超濾膜超濾后得 轉移因子一次溶液；
[0037] (7)病毒滅活：在轉移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白質量分 數為1%。，經60°C保溫10小時后，迅速將溫度降至20°C以下；
[0038] (8)二次超濾：經3K分子量的超濾膜超濾后得轉移因子溶液；
[0039] 將所得轉移因子溶液制備成轉移因子注射液。
[0040] 制備注射劑：測定轉移因子溶液中多肽和核酸的含量，加入注射用水調節至每 2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯化鈉使溶液中氯化鈉的濃度為0. 9g/ml，加入 穩定劑吐溫-80至溶液中的吐溫-80質量濃度為1%。，除菌過濾后無菌分裝即得轉移因子注 射劑。
[0041] 實施例2
[0042] 轉移因子的制