骨保護素衍生的組合物及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明大體上涉及生物制藥領域以及在與骨吸收關聯的情況中--例如在腫瘤 學中一的生物制藥的用途。更具體地，本發明涉及結合核因子kB受體活化因子配體 (RANKL)的骨保護素衍生的組合物。
【背景技術】
[0002] 在本節中描述的方法可被實行，并且不一定是先前已經構思或實行的方法。因此， 除非另有說明，不應假設在本節中描述的任何方法，僅僅因為它們包含在本節中而將其作 為現有技木。
[0003] 人類的骨保護素（0PG;基因庫：U94332. 1)是401個氨基酸的蛋白質，其包含21個 氨基酸的信號肽，其在谷氨酸22產生380個氨基酸的成熟的可溶性蛋白質之前被分開。OPG 是腫瘤壞死因子受體（TNFR)家族的ー員，在其N-末端部分中包含四個富含半胱氨酸TNFR 樣結構域。OPG已經顯示出在骨發展中發揮作用，并且缺少OPG基因的小鼠具有骨質疏松的 表型和肉眼可見的骨骼異常。
[0004]OPG--其由成骨細胞和骨髓基質細胞產生--充當沒有明顯的直接信號功能的 分泌誘餌受體。OPG通過結合其自然的配體--骨保護素配體（OPGL)起作用，其也被稱為 RANKL(核因子kB受體活化因子配體）。OPG和RANKL之間的結合阻止了RANKL激活其同源 受體RANK，RANK是對于破骨細胞分化、活化和存活至關重要的破骨細胞受體。
[0005] 重組體OPG以分別大約55kDa和IlOkDa的表觀分子量的單體和二聚體的形式存 在。N-末端結構域至半胱氨酸殘基185的截斷可能通過破壞TNFR樣結構域的二硫鍵導致 OPG失活，而蛋白質的C-末端部分至殘基194的截斷不改變生物活性。
[0006] 在轉基因小鼠中的OPG的超表達導致以小鼠中的破骨細胞幾乎完全缺乏為特征 的嚴重的骨硬化病。相反地，OPG基因的消融導致在小鼠中嚴重的骨質疏松，這顯示了OPG 在調節骨吸收中的重要的生理作用。來自于成骨細胞和基質細胞的OPG和RANKL的分泌 物由多個激素和細胞因子進行調節。OPG和RANKL產量的相對水平被認為是用于控制骨吸 收的程度：RANKL的表達增加骨吸收，而過量的OPG具有相反的效果。重組體OPG阻礙體外 和體內的刺激破骨細胞的絕大部分因素的影響。OPG也抑制多種動物疾病模型--包括卵 巢切除術、誘發型骨質疏松、惡性體液性高鈣血癥以及實驗性骨轉移--中的骨吸收。因 此，OPG可代表針對與過度的破骨細胞活動關聯的疾病的有效的治療選擇（KostenuikPJ， ShalhoubV?，發表在當今制藥（CurrPharmDes. )2001 年 5 月版；7 (8) :613-35)。
[0007] 狄諾塞麥（Denosumab)是高親和力的完全人單克隆抗體，其結合了人的RANKL并 抑制其與RANK相互作用，因此具有類似于OPG的作用方式。針對絕經后婦女骨質疏松的 預防和治療，美國食品和藥物管理局（FDA)批準了商品名為普羅利亞（Prolia)的狄諾塞 麥。針對具有來自于實體瘤的骨轉移的患者的骨骼相關事件的預防，美國食品和藥物管理 局（FDA)批準了商品名為Xgeva的狄諾塞麥。針對其它骨重塑的相關情況的狄諾塞麥的進 一步的臨床試驗目前正在進行，即，針對來自于癌癥的其它形式的骨轉移。
[0008] 因此，人們希望有ー種治療組合物，其能夠與RANKL結合并基于自然出現的OPG分 子，當具有可接受的藥理學特性時，其具有更廣泛的治療潛力。
【發明內容】
[0009] 提供本
【發明內容】
用于以簡化形式介紹以下在【具體實施方式】中進ー步說明的所選 構思。本內容不g在確定所要求保護的主題的關鍵特征或必要特征，也不g在被用作確定 所要求保護的主題的范圍的輔助。
[0010] 在某些方面，本發明提供一種結合了人的RANKL的多肽。該多肽包含第一氨基酸 序列，該第一氨基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215 (基因庫：U94332. 1)。該多肽 進ー步包含第二氨基酸序列，該第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至 329(基因庫：幾0228.1)。該多肽在具有在100叩/1111的濃度時約501^/1111或不超過10%的 半數有效濃度（EC50)的體外基于細胞的測定中能夠抑制RANKL誘導的破骨細胞分化。該 多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。
[0011] 在某些方面，本發明提供ー種治療組合物。該組合物包含結合人的RANKL的多肽。 該多肽包含人骨保護素的生物活性部分和人免疫球蛋白Y-I的Fc部分。該多肽被實質上 純化為在溶解狀態中的同型二聚體形式。該多肽在皮下給藥5mg/kg的劑量之后至少80小 時的小鼠的體循環中可顯示半衰期。在所述組合物的不超過lmg/kg的劑量、每周三次、至 少6周的皮下給藥的過程中，在鼠科動物的溶骨性模型（bonelyticmodel)中，該多肽能 夠實質上抑制由人乳腺癌誘導的骨溶解。
[0012] 在某些方面，本發明提供ー種治療組合物。該組合物包含第一氨基酸序列，該第一 氨基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步包含第二氨基酸序列，該第二 氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。該多肽可以被實質上純化至在 溶解狀態中的同型二聚體形式。該多肽在皮下給藥5mg/kg的劑量之后至少80小時的小鼠 的體循環中可顯示半衰期。在所述組合物的不超過lmg/kg的劑量、每周三次、至少6周的 皮下給藥的過程中，在鼠科動物的溶骨性模型中，該多肽能夠實質上抑制由人乳腺癌誘導 的骨溶解。該多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。
[0013] 在某些方面，本發明提供ー種編碼結合人的RANKL的多肽的分離的核酸。該多肽 包含第一氨基酸序列，該第一氨基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步 包含第二氨基酸序列，該第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。 多肽中的第一氨基酸序列可先于第二氨基酸序列。該多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序 列。核酸可針對哺乳動物細胞中的多肽的高效表達使其密碼子使用優化。核酸可包含SEQ IDN0.2的序列。核酸可包含表達載體。
[0014] 在某些方面，本發明提供一種異源表達系統。該表達系統隱含包含編碼結合人的 RANKL的多肽的核酸序列的表達載體。該多肽包含第一氨基酸序列，該第一氨基酸序列包含 人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步包含第二氨基酸序列，該第二氨基酸序列包含 人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。多肽中的第一氨基酸序列可先于第二氨基酸序 列。該多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。表達系統的表達載體可隱含于哺乳動物細 胞中。哺乳動物細胞可以是中國倉鼠卵巣（CHO)細胞。表達系統中的多肽的表達水平可以 是細胞培養的至少125毫克每公升。
[0015] 在某些方面，本發明提供一種物質的用途，該物質用于制造針對與骨吸收或重塑 關聯的疾病的治療或預防的藥物。該物質包含結合人的RANKL的多肽。該多肽包含第一氨 基酸序列，該第一氨基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步包含第二氨 基酸序列，該第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。多肽中的第 一氨基酸序列可先于第二氨基酸序列。該多肽可包含SEQIDN0.1的氨基酸序列。與骨吸 收或重塑關聯的疾病可以是癌、乳腺癌、前列腺癌、多發性骨髄瘤、由于實體瘤的骨轉移、骨 質疏松、類風濕性關節炎或牛皮癬關節炎。
[0016] 在某些方面，本發明提供一種治療或預防與骨吸收或重塑關聯的疾病的方法。該 方法包含給予需要治療或預防與骨吸收或重塑關聯的疾病的患者在治療上有效量的藥物 組合物，該藥物組合物包含結合人的RANKL的多肽。該多肽包含第一氨基酸序列，該第一氨 基酸序列包含人骨保護素的氨基酸1至215。該多肽進ー步包含第二氨基酸序列，該第二氨 基酸序列包含人免疫球蛋白Y -IFc的氨基酸103至329。多肽中的第一氨基酸序列可先于 第二氨基酸序列。該多肽可包含SEQIDN0.1的氨基酸序列。與骨吸收或重塑關聯的疾病 可以是癌、乳腺癌、前列腺癌、多發性骨髄瘤、骨肉瘤、由于實體瘤的骨轉移、骨質疏松、類風 濕性關節炎或牛皮癬關節炎。
[0017] 在此描述的本發明的這些和其它方面和優勢在結合下述附圖和【具體實施方式】后 將變得顯而易見。
【附圖說明】
[0018] 提供以下附圖和說明書用于幫助理解本發明：
[0019] 圖1示意性地示出了用在本發明的多肽的克隆中的PCDNA4-FC質粒和帶注釋的序 列的圖譜；
[0020] 圖2示意性地示出了用在本發明的多肽的克隆中的PKN002質粒和帶注釋的序列 的圖譜；
[0021] 圖3示出了在生成用于表達本發明的多肽的穩定的細胞系的過程中獲得的代表 性的轉染生長曲線；
[0022] 圖4示出了在陰離子交換層析純化步驟之后的包含SEQIDNO. 1的多肽的樣品的 尺寸排阻高效液相色譜法（HPLC)分析色譜圖；
[0023] 圖5示出了在陰離子交換層析純化步驟之后的包含SEQIDNO. 1的多肽的樣品的 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析（在還原條件下）；
[0024] 圖6示出了描繪顯示包含SEQIDN0.1的多肽的樣品的優良的分辨率 (resolution)的羥基磷灰石層析洗脫的輪廓；
[0025] 圖7示出了來自于羥基磷灰石層析的包含SEQ ID NO. 1的多肽的洗出液的主峰的 樣品的尺寸排阻HPLC分析色譜圖；
[0026] 圖8示出了用于骨溶解的評估的接種后八周時來自組1(制劑緩沖液的皮下注射 給藥）的代表性小鼠的脛骨的X射線圖像（分配的分數在每個圖像下面示出）；
[0027] 圖9示出了用于骨溶解的評估的接種后八周時來自組2 (lmg/kg的SEQIDNO. 1 的多肽的皮下注射給藥）的代表性小鼠的脛骨的X射線圖像（分配的分數在每個圖像下面 示出）；
[0028] 圖10示出了在組1、2和5的每個中的一只代表性小鼠的二維微型CT掃描圖像； 以及
[0029] 圖11示出了在組1、2和5的每個中的一只代表性小鼠的三維微型CT掃描圖像。
【具體實施方式】
[0030] 在此公開的教導是部分地基于包含融合到人IgG的Fc部分的OPG的生物活性 N-末端部分的蛋白質分子的工程。為了提供這樣的OPG衍生的蛋白質分子的重組生產，DNA 表達載體已經被構建用于在異源蛋白表達系統中過度生產蛋白質分子，并且哺乳動物細胞 已經準備穩定地表達蛋白質分子至高表達水平。出乎意料地，來自于重組體來源的蛋白質 分子形成溶解狀態中的同型二聚體和同型四聚體。已經想出允許獲得生理學有關的實質上 純的蛋白質分子的同型二聚體制劑的蛋白質純化程序。因此，在相關的體外基于細胞的測 定中，純化的蛋白質分子顯示出高度抑制RANKL誘導的破骨細胞分化。出乎意料地，根據皮 下動物給藥，蛋白質分子顯示出可接受的藥物動力學特性（pharmacokineticsprofi