一種具有藥物釋放功能的熒光納米復(fù)合物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及功能性納米復(fù)合物材料制備領(lǐng)域，特別涉及一種基于金屬增強(qiáng)熒光的 具有藥物釋放功能的熒光納米復(fù)合物的制備方法，可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化表征金屬表面所 負(fù)載藥物的釋放過(guò)程。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，傳統(tǒng)的化療藥物正面臨許多亟待解決的問(wèn)題，包括在血液循環(huán)中易被快速 清除，較差的生物分散性，以及對(duì)非癌變細(xì)胞毒性較大等缺點(diǎn)。而相較于游離的藥物分子， 基于納米粒子的藥物載體可有效提升藥物的藥理學(xué)性質(zhì)。其優(yōu)勢(shì)主要有：第一，借助腫瘤 細(xì)胞的高通透性和滯留效應(yīng)（Enhancedpermeabilityandretention,EPR)，直徑在200 納米以內(nèi)的納米粒子可選擇性地在腫瘤組織上富集，并且可以避免藥物進(jìn)入正常組織血管 中，以及被免疫細(xì)胞的吞噬作用清除；第二，某些疏水性藥物在生物體系內(nèi)的可溶性和滲透 性較差，藥物載體可有效提升其生物分散性；第三，藥物載體可提高細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，特 別是在一些抗藥性較強(qiáng)的癌細(xì)胞中，游離化療藥物常常被運(yùn)輸?shù)鞍妆贸黾?xì)胞，而藥物載體 可有效避免這種消極效果。
[0003] 當(dāng)前，大多數(shù)藥物載體的釋放過(guò)程難以用傳統(tǒng)的成像方法，如電子計(jì)算機(jī)斷層掃 描（CT)，核磁共振成像（MRI)，X射線，或是內(nèi)窺鏡檢查來(lái)表征。如何獲得藥物釋放時(shí)間、位 置和方式的直觀反饋成為藥物遞送領(lǐng)域一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。
[0004] 在本發(fā)明中，我們制備了具有巰基響應(yīng)性的核-売結(jié)構(gòu)熒光納米復(fù)合物作為藥物 載體。這種載體由聚合物殼層和作為核結(jié)構(gòu)的金屬納米粒子組成。殼層表面組裝熒光染料， 藥物分子被包疆在聚合物殼層內(nèi)部。由于聚合物殼層由二硫鍵交聯(lián)，在該納米復(fù)合物進(jìn)入 細(xì)胞后，二硫鍵被高濃度的谷胱甘肽分子打斷實(shí)現(xiàn)藥物釋放。同時(shí)，由于熒光染料與金屬納 米粒子的距離隨釋放過(guò)程變化，金屬納米粒子的增強(qiáng)熒光效應(yīng)隨之發(fā)生變化，引起體系熒 光強(qiáng)度的改變，從而藥物的釋放過(guò)程可通過(guò)熒光變化來(lái)表征。因此，本發(fā)明提供了一種基于 熒光檢測(cè)技術(shù)的可直觀反饋藥物釋放過(guò)程的納米復(fù)合物的制備方法，在癌癥治療領(lǐng)域具有 很好的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有藥物釋放載體藥物釋放過(guò)程監(jiān)測(cè)手段繁瑣，靈敏度低等 缺點(diǎn)，提供ー種可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物釋放位點(diǎn)、釋放過(guò)程進(jìn)行靈敏、便捷、有效的監(jiān)測(cè)的功能性熒 光納米復(fù)合物的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是選用含有二硫鍵的交聯(lián)劑，將生物親和性聚合物（如聚賴氨 酸分子）交聯(lián)聚合在金屬納米粒子表面，同時(shí)將藥物通過(guò)化學(xué)鍵或者靜電吸附作用與聚合 物分子結(jié)合，從而將藥物包疆在聚合物殼層中，形成ー種核-殼結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合物。然后在 所制備的納米復(fù)合物最外層組裝上熒光染料。當(dāng)環(huán)境中存在一定濃度含有巰基的還原性生 物分子時(shí)，聚合物殼層中的二硫鍵被切斷，釋放出藥物。并且殼層厚度發(fā)生改變，引起其表 面熒光物質(zhì)與金屬納米粒子之間距離的變化，從而熒光強(qiáng)度發(fā)生改變，實(shí)現(xiàn)通過(guò)對(duì)熒光強(qiáng) 度的觀測(cè)達(dá)到對(duì)藥物釋放過(guò)程監(jiān)測(cè)的目的。示意圖如圖1所示。
[0007] 本發(fā)明的具體步驟如下：
[0008] (1)將銀離子濃度為0. 5-1毫摩爾每升的新鮮配置的銀氨溶液快速加入等體積的 濃度為〇. 1毫摩爾每升的單寧酸溶液中，室溫下快速攪拌30分鐘至60分鐘，制備直徑范圍 為25-35納米的球型銀納米粒子。反應(yīng)完成后，將銀納米粒子離心洗滌，分散在等體積的水 中待用；
[0009] (2)以體積比1:20至1:5,將新鮮配置的濃度為1-10毫摩爾每升的胱氨酸溶液加 入濃度為10-12納摩爾每升的銀納米粒子溶液中，室溫?cái)?-5小吋，然后離心洗滌銀納米粒 子，除去未反應(yīng)的胱氨酸，將離心所得的銀納米粒子集中收集，分散在去離子水中，將其體 積濃縮5倍；
[0010] (3)以250:1至500:1的體積比，在濃度為0? 5-2克苺升的聚賴氨酸溶液中加入濃 度為5毫摩爾每升的阿霉素溶液，攪拌均勻后，將溶液的pH值調(diào)節(jié)在9-10,然后加入適量的 3, 3' -二硫代雙（磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯），使其濃度為0. 05-0. 2克每升。在室溫條件 下，反應(yīng)3-5小時(shí)；
[0011] ⑷以體積比5:1，向步驟（3)得到的溶液中加入步驟⑵得到的銀納米粒子。將 溶液的PH值調(diào)節(jié)在9-10,再次加入適量的3, 3' -二硫代雙（磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯）， 使其濃度為〇. 05-0. 2克每升。室溫?cái)嚢?2-15小時(shí)。反應(yīng)完成后，將粒子離心洗滌等體積 分散；
[0012] (5)以100:1的體積比，在步驟⑷所制得的納米粒子中加入濃度為2-20微摩爾 每升的熒光染料MarinaBlue?琥珀酰亞胺酯，在室溫條件下?lián)璋?-5小時(shí)。得到表面包 疆了藥物分子的核-売結(jié)構(gòu)熒光納米復(fù)合物。
[0013] 步驟（1)中所制得的金屬納米粒子優(yōu)選為銀納米粒子、金納米粒子以及金銀合金 納米粒子。
[0014] 步驟（2)中對(duì)金屬納米粒子表面進(jìn)行氨基修飾的小分子優(yōu)選為胱氨酸、2-巰基こ 胺、L-半胱氨酸等同時(shí)具有巰基和氨基的小分子化合物。
[0015] 步驟（3)中所述的聚賴氨酸可以用同樣富含氨基的殼聚糖分子及聚乙烯亞胺分 子替代。
[0016] 步驟（3)中所述藥物優(yōu)選為阿霉素，也可選擇其它帶有氨基或者羧基的藥物。
[0017] 與現(xiàn)有的藥物載體相比，本發(fā)明制備的功能性熒光納米復(fù)合物作為藥物載體具有 一定的普適性，優(yōu)選為帶有氨基基團(tuán)的藥物。由于粒子外層組裝了熒光物質(zhì)作為觀測(cè)藥物 釋放過(guò)程的指示物質(zhì)，因此不要求所選藥物具有熒光性，從而擴(kuò)大了該熒光納米復(fù)合物作 為藥物載體的實(shí)用性。
[0018] 此外，該熒光納米復(fù)合物的殼層選用聚賴氨酸、殼聚糖等生物兼容性優(yōu)異的聚合 物大分子進(jìn)行組裝，大大提高了此種藥物載體體系的細(xì)胞親和性，對(duì)正常細(xì)胞毒性小。而在 癌細(xì)胞中，其內(nèi)部谷胱甘肽含量通常大大高于正常細(xì)胞，因此，聚合物殼層的交聯(lián)點(diǎn)被谷胱 甘肽切斷，引起藥物的釋放，并且殼層厚度的改變引起熒光物質(zhì)與金屬納米粒子表面間距 的變化。由于金屬增強(qiáng)熒光效應(yīng)具有距離依賴性，通過(guò)對(duì)熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度變化的監(jiān)測(cè)可 以間接反應(yīng)出藥物釋放的過(guò)程，而通過(guò)熒光顯微鏡則可以觀察藥物釋放過(guò)程。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為所制備的熒光納米復(fù)合物的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020] 圖1中，標(biāo)記為1為金屬納米粒子，2為聚合物殼層。圖中的小黑點(diǎn)代表藥物分子， 標(biāo)記F的類太陽(yáng)符號(hào)則代表焚光分子。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1
[0022] (1)將銀離子濃度為1毫摩爾每升的新鮮配置的銀氨溶液快速加入等體積的濃度 為〇.i毫摩爾每升的單寧酸溶液中，室溫下快速撹拌半小時(shí)至ー小時(shí)，制備平均直徑為25 納米的球型銀納米粒子。反應(yīng)完成后，將銀納米粒子離心洗滌，分散在等體積的去離子水中 待用；
[0023] (2)以1:5的體積比，將濃度為1毫摩爾每升的新鮮配置的胱氨酸溶液加入濃度為 10納摩爾每升的銀納米粒子溶液中，室溫?fù)璋?5小吋，然后離心洗滌銀納米粒子，將溶液體 積濃縮5倍；
[0024] (3)以250:1的體積比，在濃度為0. 5毫克苺毫升的聚賴氨酸溶液中加入濃度為5 毫摩爾每升的阿霉素溶液，撹拌均勻后，將溶液的pH值調(diào)至pH= 10,然后加入3, 3'-二硫 代雙（磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯），使其濃度為〇. 2克每升，在室溫條件下，反應(yīng)5小吋；
[0025] (4)以5:1的體積比，在步驟⑶得到的溶液中，加入步驟⑵中得到的銀納米粒 子，將溶