一種負載7-乙基-10-羥基喜樹堿的雙靶向復合納米粒子及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于納米藥物載體領域，具體涉及一種負載7-乙基-10-羥基喜樹堿的雙 靶向復合納米粒子及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是死亡率最高的腫瘤之一，死亡人數在 世界腫瘤死亡病例中排第二位。多數患者在診斷時即為晚期轉移性疾病或在外科切除術后 出現復發轉移，5年生存率小于10%。伊立替康（CPT-Il)是廣泛應用于胃癌二線治療的半 合成可溶性喜樹堿類衍生物。同其他喜樹堿類藥物作用機理相似，它抑制拓撲異構酶I，使 其失活，引起DNA單鏈斷裂，阻礙DNA復制與RNA合成，從而抑制細胞的分裂。但是，CPT-Il 在治療效果以及臨床應用也受到了一定限制，其原因主要有兩方面，首先，CPT-Il需在體 內羧酸酯酶的作用下轉化成活性代謝物SN38發揮癌癥治療作用，但研究表明CPT-Il在人 體內轉化成SN38的效率僅為2~8%，這使得CPT-Il在體內的生物利用度極低；其次，CPT-Il 具有骨髓抑制等毒副作用，給患者在治療過程中帶來了極大的痛苦。因此，若將CPT-Il的 活性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN38)直接用于胃癌治療，將會克服CPT-Il生物利 用度低的缺陷，從而提高化療效果。但是SN38的強疏水性使其在進入人體循環系統后便迅 速析出，難以被病灶組織吸收，從而限制了其在臨床上的應用。因此，如何提高SN38在體內 的溶解度，延長其在人體內的循環時間及提高該藥物在病灶部位的有效作用濃度，是應用 SN38于胃癌治療的難點。
[0003] 靶向納米藥物傳遞系統的開發是解決上述問題最為有效的手段。一方面，納米藥 物傳遞系統可將疏水性化療藥物進行包載，提高了疏水性藥物在體內的溶解度，避免了藥 物被血液中的各種酶降解，延長其體內有效循環時間；另一方面，利用靶向配體對載體進行 靶向性修飾，使藥物可在病變部位集中釋放，提高藥物利用度并減小其毒副作用。但是簡單 的針對一個腫瘤靶點設計和開發納米藥物載體，往往達不到最好的治療效果。一方面，單靶 向納米藥物載體，只能與腫瘤細胞表面的一個目標受體結合，而這一受體可能在治療過程 中因為病理學、生理學、微環境因素的影響失去了配體之間的結合及介導作用；另一方面， 目標部位受體的表達程度也對單靶向性載體的作用產生很大的影響，而受體的超表達行為 只發生在某些特殊部位并不具有廣泛性，而這些都有可能限制單靶向性載體的配體與目標 受體的特異性結合，進而降低其靶向性及治療效果。相比之下，雙靶向載體可以提供多個靶 向識別位點與目標部位的受體實現特異性結合，也保證了目標部位受體的多樣性，減弱甚 至消除了單一受體所面臨的特異性結合率低的缺陷。因此，雙靶向性納米藥物載體在癌癥 治療中具有更強的優勢。
[0004] 在胃癌細胞表面受體的研究中發現，HER2受體在15 %?20 %的胃癌中有基因的 擴增和蛋白的過度表達，HER2陽性的胃癌浸潤性強，無病生存期短，預后差；而⑶44的高表 達與多種腫瘤的轉移和高增殖活性相關，包括胃癌。目前，可特異性識別這兩個靶點的配體 分別為AHNP多肽及透明質酸（HA)。其中，AHNP是一種最新開發出來的I. 5KDa抗HER2的 多肽片段，與HER2受體具有高親和力，可誘導受體迅速的內吞；而透明質酸（HA)是一種普 遍存在于人體內的天然多糖，具有非常好的理化特性，可生物降解，生物相容性好，無毒性， 無免疫原性，而且可與⑶44特異性結合。因此，若能利用AHNP多肽及透明質酸（HA)針對 HER2及CD44兩種受體設計一種能負載SN38的雙靶向納米藥物輸送系統，將會有可能極大 的提高化療對胃癌的治療效果。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有單靶向納米藥物運載體的不足，提供一種步驟簡單易行，可工 業化擴大生產的雙靶向復合納米粒子的制備方法。所得雙靶向復合納米粒子可對7-乙 基-10-羥基喜樹堿等疏水性藥物具有較強的包載能力以及較高的穩定性，并對同時表達 CD44及Her2的胃癌細胞具有較強的靶向性及治療效果。
[0006] 本發明利用化學鍵連接的方式將十六烷基胺與靶向多肽AHNP修飾在透明質酸 (HA)側鏈，使其成為可與胃癌細胞表面兩種靶向受體結合的兩親性類脂，并利用該靶向類 脂為乳化劑，通過一步乳化法，制備一種以可降解的高分子聚合物聚乳酸-羥基乙酸共聚 物（PLGA)為核，AHNP多肽修飾的透明質酸類脂為殼的雙靶向復合納米藥物運載體，包括如 下步驟： 51. 將十六烷基胺、AHNP多肽及透明質酸在偶聯劑作用下反應，得雙靶向類脂，將所述 雙靶向類脂配制成水溶液，即得雙靶向類脂水溶液； 52. 將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于二氯甲烷/乙醇混合溶液中，得混合有機溶液； 53. 將步驟S2中所得混合有機溶液滴加至Sl步驟中所得的雙靶向類脂水溶液中，得雙 靶向類脂乳液； 54. 將S3步驟中所得的雙靶向類脂乳液超聲后，得超聲后的雙靶向類脂乳液； 55. 將步驟S4中超聲后的雙靶向類脂乳液加入超純水中，并連續攪拌至有機溶劑完全 揮發； 56. 將步驟S5所得物質離心并收集固化的納米粒子，經過清洗干燥后，即得所述雙靶 向復合納米粒子。
[0007] 優選地，所述Sl步驟中偶聯劑為1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 和N-羥基琥珀酰亞胺。
[0008] 優選地，所述Sl步驟中透明質酸的分子量為60 KDa~200 KDa。
[0009] 優選地，所述S2步驟中聚乳酸-羥基乙酸共聚物的稱取量為10~20 mg，所述二氯 甲烷/乙醇混合溶液的添加量為0. 5~2 mL，所述二氯甲烷/乙醇混合溶液的體積比為5~2 : 1〇
[0010] 優選地，所述S3步驟中混合有機溶液與雙靶向類脂水溶液的體積比1:2~5。
[0011] 優選地，所述S4步驟中超聲功率為7~14 W，超聲時間30~180秒。
[0012] 優選地，所述S5步驟中超聲后的雙靶向類脂乳液與超純水的體積比為1:2~5。
[0013] 本發明還提供一種雙靶向復合納米粒子負載疏水性藥物的制備方法，包括以下步 驟： SI.利用1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺作為偶 聯劑，將十六烷基胺及AHNP多肽，連接至分子量范圍為60 KDa~200 KDa的透明質酸的側鏈 羧基端，即得雙靶向類脂，并將所述雙靶向類脂配制成濃度范圍為〇. 5~5 mg/mL的水溶液， 得雙靶向類脂水溶液； 52. 稱取10~20 mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物，并按照質量比聚乳酸-羥基乙酸共聚物： 疏水性藥物為5~20:1來稱取疏水性藥物，將上述兩種物質溶于0. 5~2 mL的二氯甲烷/乙 醇混合溶液，所述二氯甲烷/乙醇混合溶液的體積比為5~2 :1，得混合有機溶液； 53. 將S2步驟中所得混合有機溶液添加至Sl步驟中所得雙靶向類脂水溶液中，得雙 靶向類脂乳液； 54. 將S3步驟中所得的雙靶向類脂乳液在超聲功率為7~14 W，超聲時間為30~180s條 件下，得超聲后的雙靶向類脂乳液； 55. 將步驟S4中超聲后的雙靶向類脂乳液按1:2~5的體積比加入超純水中，連續攪拌 5 h，使有機溶劑完全揮發； 56. 將步驟S5所得物質通過離心收集固化的納米粒子，并用超純水清洗2~4次后冷凍 干燥，即得負載疏水性藥物的雙靶向復合納米粒子； 優選地，所述疏水性藥物包括7-乙基-10-羥基喜樹堿。
[0014] 本發明利用自主研發的雙靶向類脂的兩親性，通過一步乳化法，制備一種以可降 解的高分子聚合物PLGA為核，雙靶向類脂為殼的雙靶向復合納米粒子，中心粒徑分布在 200~400 nm之間。一方面，雙靶向類脂中的透明質酸可在復合納米粒子表面形成水化層， 阻礙體內血清中調理素及脂蛋白的吸附，提高納米粒子在體內的穩定性，延長其體內的循 環時間；另一方面，復合納米粒子殼層中的透明質酸和AHNP靶向多肽能有效促進納米粒子 與同時表達CD44及Her2的胃癌細胞的特異性結合，提高局部藥物濃度，從而使其具有更好 的治療效果。
[0015] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 本發明提供的負載7-乙基-10-羥基喜樹堿的雙靶向復合納米粒子，不僅載藥量大，包 封率高，而且延長了 7-乙基-10-羥基喜樹堿在體內的有效作用時間，并通過主動靶向作用 有效的促進了納米粒子與腫瘤細胞的結合，降低了藥物對正常細胞的杜甫作用，顯著提高 了藥物的治療效果。
【附圖說明】
[0016] 圖1為實施例1合成的雙靶向類脂的氫核磁共振譜圖及紫外可見光譜圖。
[0017] 圖2為實施例2制備的雙靶向復合納米粒子的掃描電鏡照片。
[0018] 圖3為實施例3雙靶向復合納米粒子在含有10%胎牛血清蛋白的PBS中不同時間 段的粒徑分布圖。
[0019] 圖4為實施例4負載香豆素6的雙靶向復合納米粒子與HGC27細胞作用4h后的 激光共聚焦顯微鏡照片。
【具體實施方式】
[0020] 如無特別說明，本實驗中所使用的溶劑和試劑均購買自市售商品，使用前未經純 化。
[0021] 實施例1 將50 mg不同分子量的透明質酸（HA，60 KDa~200 KDa)分別溶解在無水甲酰胺中，之 后加入一定量的EDC，NHS和十六烷基胺（HAD)，其摩爾量分別為透明質酸中羧基摩爾量的 15%，15%以及10%。并在室溫下攪拌反應24 h。反應結束后，將反應溶液滴加至過量的無 水乙醇中，使連有十六烷基胺的透明質酸沉淀出來并離心收集，并重