人心臟瓣膜組織脫細胞基質及其制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及心臟組織脫細胞基質的制備及其在細胞培養及組織工程的基礎研宄 及應用，屬于生物醫藥，組織工程學，細胞生物學，干細胞生物學及心臟大血管外科領域。
【背景技術】
[0002] 心血管疾病是一個全球性的健康問題。世界上大約三分之一的人是死于心血管疾 病。心肌梗死及充血性心力衰竭是心血管疾病導致死亡的主要原因，而心肌梗死又是引起 充血性心力衰竭的重要原因。對于心肌梗死的治療目前主要是恢復缺血區周圍心肌組織的 血流量，一般采取藥物護心、冠狀動脈支架植入和實施搭橋手術等傳統方法，但這些治療措 施只能保護殘存的心肌，對已梗死的心肌無法修復。而心臟移植的供體不足和強烈的免疫 反應以及高昂的治療費用，故難以在臨床上大范圍應用。最近研宄顯示應用骨髓干細胞移 植可改善心肌修復，具有傳統治療方法所無可比擬的優越性，為治療心肌梗死提供了一種 全新治療前景。
[0003] 骨髓干細胞在心肌再生及心臟損傷修復中已有成功的報道。c-kit作為心臟干細 胞標記物，已有報道顯示小鼠 C-kit陽性骨髓干細胞移植入梗死心肌周邊區后發現在梗死 區重新產生新的心肌細胞，梗死區及周邊毛細血管密度顯著增加。這一重要發現提供了骨 髓干細胞能分化為心肌細胞和血管的初步實驗依據。
[0004] 目前利用骨髓干細胞修復心臟損傷的研宄中主要采用的是細胞移植的方法，將骨 髓細胞直接移植到心梗區中。心肌細胞作為分化成熟的細胞自身的損傷后很難再生，而僅 僅通過干細胞原位注入治療的效果有限。而心肌細胞是存在于大量外基質（ECM)中的，其 主要成分是心肌間隙中成纖維母細胞產生和分泌的膠原纖維，對維持心臟正常的形態和 功能起重要作用，心肌膠原纖維相互交織，形成多層次、多方位、復雜的三維空間結構，在支 持、保護心肌細胞、協調心肌收縮、舒張等方面發揮重要作用。因此，給骨髓細胞提供一個心 臟的基質環境可以更有助于其對心肌缺損的修復。
[0005] 脫細胞材料由于其成分最接近與相對應的組織的成分，所以其應用越來越廣泛。 然而因為細胞不易脫凈，應用較多的都是膜狀的組織的脫細胞基質材料，如羊膜，小腸粘膜 下層（SIS)等。而心臟這樣的實質性器官并未見脫細胞基質研宄。然而羊膜，真皮，小腸粘 膜下層這些膜狀組織，其膠原纖維層次及結構與心臟組織相差甚遠，并不能提供相似于心 臟的基質環境。
[0006] 本發明創立了薄片狀的脫細胞方法，可以解決傳統的實質性組織脫細胞方法耗時 較長，很難將中間部分的細胞脫盡的問題，切成膜片后由于膜片厚度接近于細胞的直徑，故 組織中的細胞大部分能夠暴露在脫細胞溶液中，較容易脫盡細胞，耗時可以大大縮短。再 者，膜片形式的構建細胞也能解決細胞難以進入材料的問題，使細胞更好的材料復合。因此 本發明提出：將人心臟瓣膜切成薄片的形式，進行脫細胞處理，切成膜片的組織較易脫盡細 胞。將脫細胞基質及骨髓C-kit陽性干細胞復合制成復合補片，利用脫細胞基質提供生物 信號，提高細胞增殖、黏附、分泌等生物學特性。細胞，并用其修復心肌損傷，心肌損傷修復 改善明顯。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種人心臟瓣膜組織脫細胞基質及其制備和用途。
[0008] 為了達到上述目的，本發明提供了一種人心臟瓣膜組織脫細胞基質，其特征在于， 其制備方法包括：將人的心臟瓣膜組織切成厚度為50-100 μm的薄片；將所得的薄片進行 脫細胞處理，得到心臟瓣膜脫細胞基質，冷凍干燥、消毒備用。
[0009] 優選地，所述的心臟瓣膜組織來自瓣膜置換術患者的廢棄瓣膜組織。
[0010] 優選地，所述的脫細胞處理包括：將所得的薄片加入離心管中，加入質量分數為 0.5?1.5%的十二烷基硫酸鈉（505)，放入溫度為36?38°〇、轉速為150?2001'/11^11的 搖床中消化12?24h，洗滌，得到消化后的人心臟瓣膜組織，加入150?250mg/L DNA酶I 溶液，反應2?6小時，洗滌，得到心臟瓣膜脫細胞基質。
[0011] 本發明還提供了上述的人心臟瓣膜組織脫細胞基質的制備方法。
[0012] 本發明還提供了上述的人心臟瓣膜組織脫細胞基質作為組織工程支架在制備組 織工程移植物中的應用。
[0013] 優選地，所述的組織工程移植物為用于修復缺血性心肌損傷、改善心臟功能、改善 心力衰竭或其他原因造成的心肌重構的組織工程移植物。
[0014] 本發明還提供了上述的人心臟瓣膜組織脫細胞基質作為細胞體外培養介質提供 促進細胞黏附、存活、增殖和心臟方向分化的微環境及細胞外基質架構中的應用。
[0015] 本發明還提供了一種心臟補片（或稱心臟移植物或心肌補片），其特征在于，包含 種子細胞以及上述的人心臟瓣膜組織脫細胞基質。
[0016] 優選地，所述的種子細胞為骨髓來源的c-kit+細胞骨髓單個核細胞、間充質干細 胞、心肌去分化細胞、心肌干細胞及胚胎干細胞來源的細胞（如人來源的干細胞）中的至少 一種。
[0017] 本發明還提供了上述的心臟補片的制備方法，其特征在于，具體步驟包括：將種子 細胞種于上述人心臟瓣膜組織脫細胞基質的制備方法所制備的人心臟瓣膜組織脫細胞基 質上，培養得到心肌補片。
[0018] 優選地，所述的種子細胞為c-kit陽性細胞。
[0019] 更優選地，所述的c-kit陽性細胞為小鼠骨髓來源的c-kit陽性的細胞，其制備方 法包括：取心梗3天后的小鼠的脛骨和肱骨，用Hanks平衡鹽溶液沖出骨髓，分離出骨髓單 個核細胞，磁珠分離得到c-kit陽性細胞。
[0020] 優選地，所述的培養步驟包括用含有10 %?25 %的FBS的MDM培養基在含3? 8% 0)2的36?38°C培養箱培養5?15天。
[0021] 更優選地，所述的培養過程中每隔2?3天換半量換培養液。
[0022] 本發明驗證了此心臟補片對心功能的修復狀況以及心臟組織脫細胞基質作為細 胞體外培養介質提供促進細胞黏附，存活，增殖，心臟方向分化的微環境及細胞外基質架 構。
[0023] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0024] 1、本發明將得到的人組織先切成薄片后再進行脫細胞操作，在保證脫細胞徹底性 的同時極大的縮短了脫細胞時間，從而節省了大量的時間，確保今后商品化的可能。人來源 心臟組織脫細胞基質體外具有促進細胞黏附，增殖及其向心肌方向分化的能力，與合成材 料相比，更能充分模擬人心肌細胞生長微環境，具有更適宜的生長及誘導環境。因此可以作 為細胞體外培養介質提供促進細胞黏附，存活，增殖，心臟方向分化的微環境及細胞外基質 架構。
[0025] 2、c_kit陽性細胞作為骨髓中一群干細胞已經被證實可向心肌，平滑肌，內皮細胞 方向分化，在心梗修復中發揮重大作用。C-kit陽性細胞在體外無法長期存活，增殖能力差， 對于細胞治療來說無法達到足夠的細胞數量。本發明中心臟組織脫細胞基質在體外可以促 進c-kit陽性細胞大量增殖，從而為細胞治療創造可以獲得足夠種子細胞的方法。本發明 首次將骨髓來源的c-kit陽性細胞種植于本發明中提到的人瓣膜脫細胞基質上，并在體外 證實脫細胞基質可促進其向心肌方向發生分化。該發明首次將上述組織工程化獲得基于人 瓣膜脫細胞基質的心肌移植物移植到心梗區可明顯防止心肌重塑和改善心功能。
[0026] 3、本發明中還發現了人心臟瓣膜脫細胞基質在體外細胞培養中具有促進干細胞 黏附，增殖及心肌方向分化的作用，移植到心梗心臟表面可以有效改善心功能，因此可以作 為新的體外細胞培養介質及移植物用于心臟病干細胞治療。
【附圖說明】
[0027] 圖IA為來自瓣膜置換術患者的廢棄人心臟瓣膜組織照片；
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