一種膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及神經(jīng)支架技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于各種外傷原因?qū)е碌闹車窠?jīng)損傷或斷裂造成傷者感覺和運(yùn)動(dòng)功能的下降或喪失。嚴(yán)重的外周神經(jīng)損傷往往導(dǎo)致患者癱瘓或永久喪失勞動(dòng)力。外周神經(jīng)損傷在我國(guó)發(fā)病率較高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在外傷患者中，四肢神經(jīng)傷約占外傷總數(shù)的10%，火器傷骨折中約有60%的合并神經(jīng)傷。為此，需尋找理想的外周神經(jīng)傷治療手段。對(duì)于外周神經(jīng)斷裂類損傷，若斷裂缺口較大，就須借助對(duì)缺口進(jìn)行橋接移植手術(shù)才能使斷裂的周圍神經(jīng)得到再生修復(fù)。
[0003]目前，常用的移植體有自體移植體和人工神經(jīng)支架。自體移植體來(lái)源有限且會(huì)帶來(lái)供體后遺癥。人工神經(jīng)支架方面，由于非降解導(dǎo)管材料可能導(dǎo)致神經(jīng)壓迫和二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，近年來(lái)研宄的主要趨向于生物可降解支架材料的開發(fā)和研宄。當(dāng)前，美國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)多種品牌，如，NeuraGen、SaluBridge, Neurolac等的神經(jīng)導(dǎo)管用于臨床。然而，我國(guó)在神經(jīng)支架方面的研宄較為落后，并沒有開發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的神經(jīng)導(dǎo)管。
[0004]石羥基磷灰石(HAP)是脊椎動(dòng)物骨骼和牙齒的主要組成，人的牙釉質(zhì)中羥基磷灰石的含量在96%以上。羥基磷灰石具有優(yōu)良的生物相容性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架及其制備方法，該方法制備的神經(jīng)支架力學(xué)性能良好，生物可降解，具有神經(jīng)再生所需要的三維結(jié)構(gòu)和NGF，對(duì)神經(jīng)修復(fù)具有深遠(yuǎn)的意義。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架，包括支架膜料以及支架膜料包裹的可降解金屬絲，所述支架膜料的主要成分為膠原蛋白，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和羥基磷灰石。
[0007]所述NGF與明膠制成NGF明膠微球分布與所述支架膜料中，所述NGF明膠微球的質(zhì)量含量為PLGA粉末和膠原蛋白粉末總質(zhì)量含量的20-40%。
[0008]所述支架為片狀，長(zhǎng)條狀或圓柱狀。
[0009]所述可降解金屬絲沿所述支架的縱向和橫向分布。
[0010]所述可降解金屬絲的主要成分為鎂，鋅，鈣，鐵或其合金。
[0011]所述膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架的制備方法，包括如下步驟:
[0012]I)膠原蛋白粉末的制備:動(dòng)物皮去除皮下脂肪組織后，洗凈，切碎，在堿性溶液中脫脂18_36h ;用清水漂洗三次，每次18-24h ;于0.5%的胰蛋白酶中在37°C振蕩浸泡18-30h ;在 1mMTrisHCl (pH8.0)+2% TritonX-1OO 中在 37°C振蕩浸泡 48_72h ;室溫下用清水清洗2d ;取出用滅菌的PBS浸泡，冷凍干燥后經(jīng)機(jī)械粉碎，過400目分子篩，得到膠原蛋白粉末；所述膠原蛋白粉末的主要成分為膠原蛋白，還含有纖維連接蛋白和層粘連蛋白；
[0013]2)復(fù)合材料的制備:按質(zhì)量比例8-6:2-4稱量羥基磷灰石粉末和步驟I)所得膠原蛋白粉末，加入蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液PH值為8-9，用磁力攪拌器攪拌經(jīng)加熱至36-39?，繼續(xù)攪拌8-10h，真空干燥，得到復(fù)合物粉末；
[0014]3) NGF明膠微球的制備:在20 %的明膠水溶液中加入NGF，所述NGF濃度為0.06-0.10 μ g/ml,將混合溶液加入要其體積3.5倍的色拉油中，預(yù)熱到37°C以1000rpm攪拌1min乳化形成油水乳液，冷凍至_20°C，取出乳液放入冷凍離心機(jī)中以2000rpm離心1min,取沉淀物，用丙酮洗滌3-5次，洗滌后的沉淀物即為NGF明膠微球；
[0015]4)制備支架膜料:將復(fù)合物粉末完全溶解在二氯甲烷中，加入步驟3)所得NGF明膠微球，超聲分散均勻，得到支架膜料；
[0016]5)將步驟4)所得支架膜料轉(zhuǎn)入制膜模具的模具腔中，模具腔中沿支架膜料成型方向的橫向和縱向放置拉直的可降解金屬絲，使可降解金屬絲浸入支架膜料中，溶劑自然揮發(fā)干燥，抽真空48h，此時(shí)，干燥的支架膜料包裹所述可降解金屬絲，得到所述神經(jīng)支架。
[0017]所述NGF明膠微球的粒經(jīng)為1-20 μ m，微球?qū)GF的封載率為81.5%。
[0018]所述NGF明膠微球的用量為膠原蛋白-羥基磷灰石復(fù)合材料總量的20-40%。
[0019]動(dòng)物皮被處理后，脫出了細(xì)胞，形成了結(jié)構(gòu)松散的ECM，其主要成分是膠原蛋白，還含有纖維連接蛋白，層粘連接蛋白，氨基葡聚糖，蛋白聚糖等，這些有利于神經(jīng)傳導(dǎo)以及軸突的生長(zhǎng)，具有良好的生物相容性。將ECM單獨(dú)用于神經(jīng)損傷移植，會(huì)由于ECM太軟，難以為神經(jīng)生長(zhǎng)提供形態(tài)學(xué)上的支撐，同時(shí)，短時(shí)間內(nèi)，這些ECM就會(huì)被鈣化。因此，將膠原蛋白與石羥基磷灰石結(jié)合使用使得制成的支架具有一定的力學(xué)性能，能夠?yàn)樯窠?jīng)生長(zhǎng)提供形態(tài)學(xué)上的支撐，也防止膠原蛋白鈣化。另外，掃描電子纖維鏡表明，所得人工神經(jīng)支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)為蜂窩狀，為神經(jīng)細(xì)胞的爬行和生長(zhǎng)提供了空間。
[0020]可降解金屬及其合金可以引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，從而有利于神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。
[0021]NGF是生物活性物質(zhì)，在周圍神經(jīng)修復(fù)的過程中，神經(jīng)組織會(huì)分泌NGF，添加外源的NGF有利于神經(jīng)的修復(fù)。本發(fā)明中，使用明膠制備NGF明膠微球，由于明膠是水溶性物質(zhì)，在有機(jī)溶劑中不溶解，在材料的制備中明膠可將NGF與有機(jī)溶劑隔離，從而有利于保持NGF活性。明膠還有助于所述NGF的緩慢釋放。
[0022]石羥基磷灰石(HAP)是脊椎動(dòng)物骨骼和牙齒的主要組成，人的牙釉質(zhì)中羥基磷灰石的含量在96%以上。羥基磷灰石具有優(yōu)良的生物相容性。神經(jīng)支架中加入石羥基磷灰石可以賦予支架良好的力學(xué)性能。
[0023]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所述膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架力學(xué)性能良好，生物可降解，具有神經(jīng)再生所需要的三維結(jié)構(gòu)和NGF，對(duì)神經(jīng)修復(fù)具有深遠(yuǎn)的意義。
【附圖說(shuō)明】
:
[0024]圖1為本發(fā)明所述膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]圖2為本發(fā)明中豬皮經(jīng)脫細(xì)胞處理后形成的疏松多孔的三維結(jié)構(gòu)。
[0026]圖3為顯微鏡下本發(fā)明中所得NGF明膠微球的形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖和優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0028]參照?qǐng)D1，一種膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架，包括支架膜料I以及支架膜料I包裹的可降解金屬絲2。所述可降解金屬絲2沿神經(jīng)支架的橫向和縱向分布。所述支架可以根據(jù)使用需要制備成各種形狀，一般為圓筒形，也可以是片狀。
[0029]所述支架膜料I主料為膠原蛋白-羥基磷灰石復(fù)合材料；所述NGF明膠微球的質(zhì)量含量為膠原蛋白-羥基磷灰石復(fù)合材料總質(zhì)量含量的20-40%。
[0030]所述可降解金屬絲2的主要成分為鎂，鋅，鈣，鐵或其合金。
[0031]實(shí)施例1:所述膠原蛋白-羥基磷灰石神經(jīng)支架的制備方法，包括如下步驟:
[0032]I)膠原蛋白粉末的制備:動(dòng)物皮去除皮下脂肪組織后，洗凈，切碎，在堿性溶液中脫脂24h ;用清水漂洗三次，每次20h ;于0.5%的胰蛋白酶中在37°C振蕩浸泡124h ;在1mMTrisHCl (pH8.0)+2% TritonX-1OO中在37°C振蕩浸泡56h ;室溫下用清水清洗2d ;取出用滅菌的PBS浸泡，冷凍干燥后經(jīng)機(jī)械粉碎，過400目分子篩，得到膠原蛋白粉末；所述膠原蛋白粉末的主要成分為膠原蛋白，還含有纖維連接蛋白和層粘連蛋白；
[0033]用H.E染色及掃描電鏡觀測(cè)所得膠原蛋白粉末，如圖2所示。經(jīng)觀察可知，豬皮經(jīng)脫細(xì)胞處理后形成疏松多孔的三維結(jié)構(gòu)。
[0034]2)復(fù)合材料的制備:按質(zhì)量比例8-6:2-4稱量羥基磷灰石粉末和步驟I)所得膠原蛋白粉末，加入蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液PH值為8-9，用磁力攪拌器攪拌經(jīng)加熱至36-39?，