治療性hbv微環dna疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和DNA疫苗制備領域，具體地說，涉及一種治療性HBV微環 DNA疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)在全球范圍廣泛流行。HBV感染可引起急、慢性和重型肝炎， 并與肝硬化、肝癌的發病密切相關，是嚴重危害人類健康的感染性疾病。目前全球約有3. 5 億慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75%分布在亞太地區，我國的慢性無癥狀感染者超過 1. 2億，且慢性乙型肝炎預后不良。目前的抗病毒藥物主要是核苷類似物和重組干擾素類藥 物，但效果不十分理想。因此，急需一種更有效的治療藥物，清除肝細胞的cccDNA病毒，使 患者痊愈。
[0003] DNA疫苗，是將外源目的基因構建于真核表達載體的質粒，可直接注射到動物體內 的第三代疫苗。由于可在體內表達目的抗原，通過外源性、內源性以及交叉抗原遞呈途徑被 DC細胞提呈，有效激活⑶4+Thl和⑶8+T細胞，因此特別有利于誘導Thl型免疫應答，打破 慢性乙肝患者的免疫耐受狀態，清除病毒，使患者痊愈。
[0004] 基因載體的選擇對DNA疫苗的構建至關重要，一方面，標準質粒的骨架DNA成分均 包括DNA復制起始位點、抗菌素抵抗基因等，這些成分會抑制目的基因表達，并且載體基因 DNA可能插入宿主基因組，誘發插入突變和基因沉默的危險；另一方面，標準質粒轉導效率 低，目的基因只能實現瞬間表達，其分子量較大，容易引發免疫反應和被機體所清除。因此， 安全高效的表達是研宄核酸DNA疫苗基因治療的關鍵。
[0005] Chen 等（Mar A.Kay,Cheng-Yi He,Zhi-Ying Chen.A robust systemfor production of minicircle DNA vectors. Nature Biotechnology, (2010). doi:10. 1038/ nbt. 1708)開發的微環DNA載體（MC)技術和微環生成菌株大腸桿菌ZYCY10P3S2T有助于解 決以上問題。MC是一種環狀表達盒子，不含標準質粒中細菌骨架DNA，能在體內長期表達高 水平的目的基因產物。MC在結構、基因表達的持久性和細胞內穩定性等方面與共價鍵密閉 環狀DNA (cccDNA)相同，使MC成為安全、高效的理想載體之一。微環DNA的制備方法是將含 目的基因的親本質粒（PP)轉化入宿主菌ZYCY10P3S2T后，以阿拉伯糖誘導重組酶的表達， 重組酶介導其識別位點發生重組，使PP重組形成含細菌骨架的微質粒（miniplasmid，MP) 和含目的基因表達盒的微環（minicircl e，MC)DNA。通過宿主菌體內聯合表達I-SceI內切 酶，將MP和PP質粒酶切，使之成為線性DNA，繼而在宿主菌內降解，通過常規質粒分離方法 即可獲得高純度的微環DNA。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種新型的治療性HBV微環DNA疫苗。
[0007] 本發明的另一目的是提供上述微環DNA疫苗的制備方法。
[0008] 為了實現本發明目的，本發明的一種治療性HBV微環DNA疫苗，所述疫苗包括雙質 粒，即含有編碼HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微環DNA質粒以及含有編碼hIL2-IFNy融 合蛋白基因的微環DNA質粒。所述雙質粒中均不含有原核質粒的復制元件和抗菌素元件。
[0009] 上述疫苗的制備方法包括以下步驟：
[0010] 1)分別以質粒 preS2. S/pcDNA3. 1 和 hIL2-IFNy/pcDNA3. 1 為模板，設計引物，進 行PCR擴增，得到目的片段；
[0011] 2)用BglII和Sail同時雙酶切目的片段和ZY781載體，回收，連接，將目的片段 分別克隆至載體ZY781的多克隆位點上，即得親本質粒preS2. S/ZY781和hIL2-IFNy/ ZY781 ；
[0012] 3)分別用上述親本質粒轉化大腸桿菌ZYCY10P3S2T，過夜培養，質粒酶切及測序 驗證插入正確的片段；
[0013] 4)按0· 25%。的接種量分別將上述菌液接入含kana的TB培養液中，37°C，250rpm 過夜培養，取過夜培養的菌液與Minicle Induction Mix按等體積混合，于32°C，250rpm反 應5-8h，反應結束后，離心提質粒，即得含有編碼HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微環DNA 質粒pMCS2. S，以及含有編碼hIL2-IFNy融合蛋白基因的微環DNA質粒pMCIIF ;
[0014] 5)分別對含有上述質粒pMCS2. S和質粒pMCI IF的陽性克隆進行菌株發酵培養，發 酵結束后，離心提質粒，純化。
[0015] 其中，步驟1)中所述引物包括：
[0016] 上游引物 5' -GAAGATCTGGCGGGTTGACATTGATTATTGACTAG-3' 和
[0017] 下游引物 5 ' -ACGCGTCGACCCATAGAGCCCACCGCAT-3 ' ；
[0018] 步驟4)中所述Minicle Induction Mix的制備方法為：向100ml L B中加入IM NaOH 4ml和20 %阿拉伯糖200 μ 1，混合后經0. 22 μ m濾膜過濾。
[0019] 本發明還提供含有所述疫苗的用于預防和/或治療乙型肝炎的藥物。
[0020] 本發明還提供所述疫苗在制備用于預防和/或治療乙型肝炎的藥物中的應用。
[0021] 本發明提供的治療性HBV微環DNA疫苗，包括含有編碼HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微環DNA質粒pMCS2. S以及含有編碼hIL2-IFNy融合蛋白基因的微環DNA質粒 pMCIIF。質粒pMCS2. S和pMCIIF中均不含原核質粒的復制元件和抗菌素元件，可游離于宿 主細胞基因組DNA之外穩定持久地表達外源目的基因，成功實現了在C0S-7細胞中表達外 源基因，誘導Balb/c小鼠產生針對乙型肝炎病毒的高水平IFN γ的Thl型免疫應答和特異 性殺傷應答。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發明微環DNA質粒生成示意圖。
[0023] 圖2為本發明微環DNA質粒pMCS2. S和pMCIIF構建流程圖。
[0024] 圖3為本發明質粒及質粒酶切后的電泳結果；其中，l.DL2000marker ;2. ZY781 空載體；3. pMCS2. S 質粒；4. preS2. S/ZY781 質粒；5. pMCS2. S 質粒雙酶切后；6. preS2. S/ ZY781質粒雙酶切后；7. pMCIIF質粒；8. hIL2-IFN γ/ZY781質粒；9. pMCIIF質粒雙酶切后； 10.hIL2-IFNy//ZY781 質粒雙酶切后。
[0025] 圖4為本發明pMCIIF和hIL2-IFNy /pcDNA3. 1質粒轉染C0S-7細胞后IL2的表 達量。
[0026] 圖5為本發明pMCIIF和hIL2-IFNy /pcDNA3. 1質粒轉染COS-7細胞后IFNy的 表達量。
[0027] 圖6為本發明實施例3中各實驗組ELISPOT斑點直觀示意圖；其中，a.生理 鹽水對照組；b. PHA陽性對照組；c. pcDNA3. l/preS2. S質粒實驗組；d pcDNA3. l/preS2. S+pcDNA3. l/hIL2-IFNy 雙質粒實驗組；e. pMCS2. S微環質粒實驗組；f. pMCS2. S+pMCIIF雙 微環質粒實驗組。
[0028] 圖7為本發明實施例3中各實驗組ELISPOT斑點統計結果。
【具體實施方式】
[0029] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0030] 實施例1治療性HBV微環DNA疫苗的制備
[0031] 包括以下步驟：
[0032] 1.弓丨物設計和PCR擴增目的片段
[0033] 基于重組質粒 preS2. S/pcDNA3. 1 和 hIL2-IFN γ /pcDNA3. 1 (構建方法見：何 曉嬙，陳光明，黃英，等.治療性雙質粒HBV DNA疫苗的構建和鑒定.解放軍醫學雜 志，2003, 28(6) :493-498)的序列，在目的基因的增強子上游和polyA下游設計引物，用于 擴增含有目的基因及其上下游的增強子、啟動子和polyA調控序列的DNA片段。設計的引 物序列如下：
[0034] F: 5，-GAAGATCTGGCGGGTTGACATTGATTATTGACTAG-3 '
[0035] R: 5 ' -ACGCGTCGACCCATAGAGCCCACCGCAT-3 '
[0036] 分別以質粒 preS2. S/pcDNA