一種對肝癌細胞具有還原響應性和細胞靶向的介孔磷灰石納米藥物載體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫用材料領域，具體涉及一種對肝癌細胞具有還原響應性和細胞靶向的介孔磷灰石納米藥物載體的制備方法。
【背景技術】
[0002]癌癥(惡性腫瘤)已成為當前威脅人類健康的最主要疾病之一，并且其發病率保持逐年上升的趨勢。目前，化學療法仍然是最重要的治療手段。傳統的化療方法，由于抗癌藥物不能特異識別靶細胞，藥物進入體內后分布在體內的各個器官中，對病變部位的特異性分布較少。這些藥物的細胞毒性較大，能殺傷腫瘤細胞的同時也能破壞正常的組織細胞，具有嚴重的副作用，給患者帶來極大的痛苦。因此，構建新型的智能響應控制釋放體系，使其不僅能特異性的識別靶向細胞，還能定時、定量的將藥物導入病變部位，提高藥物的利用率，減少毒副作用，具有重要的作用。
[0003]近年來一系列環境響應性的新型細胞靶向控釋體系被構建，他們通過靶向部位的特殊環境刺激，藥物系統產生響應性將藥物可控釋放到靶向部位起到治療作用。這一新型靶向藥物體系在體內循環系統中能夠穩定的存在，而在靶向部位由于環境的改變，載藥系統隨機產生響應性，一般通過載體解離，鍵斷裂，降解等方法使藥物釋放到靶向部位。
[0004]目前，介孔硅以其優異的性能在智能藥物控釋體系中被廣泛應用為藥物載體，但介孔硅作為藥物載體難以降解，而且介孔硅載體的過度使用可能引起一些副作用，像細胞突變、慢性支氣管炎甚至肺癌，因此，構建新型的藥物載體仍然是一個大的挑戰。
【發明內容】
[0005]本發明是為了解決當前藥物載體毒副作用大，難以降解的問題，而提供了一種對肝癌細胞具有還原響應性和細胞靶向的介孔磷灰石納米藥物載體的制備方法。
[0006]本發明的一種對肝癌細胞具有還原響應性和細胞靶向的介孔磷灰石納米藥物載體的制備方法按以下步驟進行:
[0007]一、模板劑的準備:將模板劑F127和泛酸鈣單水合物溶解在去離子水中，在攪拌速度為250r/min?400r/min下攪拌至得到清晰乳狀液，得到F127-泛酸鈣混合液，即得到豐旲板劑;
[0008]步驟一中所述的模板劑F127與泛酸鈣單水合物的質量比為1: (4?8);步驟一中所述的模板劑F127與去離子水的質量比為1: (30?100)；
[0009]二、介孔羥基磷灰石納米粒子的制備^fK2HPO4.3H20溶解在去離子水中，得到K2HPO4溶液，然后用NH 3 -H2O調解K2HPO4溶液的pH值至pH值為10?14，再將pH值為10?14的K2HPO4溶液以滴加速度為1.0g/min?3.0g/min滴加到F127-泛酸鈣混合液中，攪拌均勻后采用水浴回流的方式進行加熱，控制水浴加熱溫度為80?100°C，回流時間為24h?48h，完成水浴回流反應，將水浴回流反應后的溶液過濾，收集白色沉淀物，將白色沉淀物在溫度為80?150°C的真空條件下干燥12h?24h，得到干燥后的白色沉淀物，然后將干燥后的白色沉淀物在溫度為200?300°C下預燒2h?6h，再在馬弗爐中煅燒，控制煅燒溫度為500?600°C，煅燒時間為6h?10h，得到介孔輕基磷灰石納米粒子；
[0010]步驟二中所述的K2HPO4.3H20與去離子水的質量比為1: (10?13);步驟二中所述的PH值為10?14的K2HPO4S液中的K 2ΗΡ04.3H20質量與F127-泛酸鈣混合液中F127的質量比為(2?5):1 ；
[0011]三、介孔羥基磷灰石的氨基化:將步驟二得到的介孔羥基磷灰石納米粒子均勻分散在甲苯溶液中，在攪拌速度為300r/min?600r/min下攪拌1min?30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于溫度為60?80°C的水浴鍋中回流24h?48h，離心冷凍干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；
[0012]步驟三中所述的介孔羥基磷灰石納米粒子的質量與甲苯溶液的體積的比為Ig:(50?100)mL ;步驟三中所述的甲苯溶液與3-氨丙基三甲氧基硅烷的體積比為(8?12):I ;
[0013]四、介孔磷灰石的羧基化:將步驟三得到的氨基化的介孔磷灰石均勻分散在丙酮溶液中，然后在室溫下以攪拌速度為400r/min?600r/min攪拌5.5h?6.5h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再將丁二酸酐逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在室溫下繼續以攪拌速度為300r/min?500r/min攪拌24h?48h，然后依次用蒸飽水和無水乙醇洗滌并離心10?20次，最后冷凍干燥，得到羧基化的介孔磷灰石；
[0014]步驟四中所述的氨基化的介孔磷灰石的質量與丙酮溶液的體積的比為Ig: (65?85)mL ;步驟四中所述的氨基化的介孔磷灰石與丁二酸酐的質量比為1: (5.5?8.5);
[0015]五、二硫鍵功能化的介孔磷灰石的制備:將步驟四得到的羧基化的介孔磷灰石、1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺溶解在PBS緩沖溶液中，在攪拌速度為300r/min?600r/min條件下攪拌3.5h?4.5h，得到混合溶液A，然后將胱胺鹽酸鹽加入到混合溶液A中，在室溫下以攪拌速度為200r/min?500r/min攪拌24h?48h，然后依次用蒸餾水和無水乙醇洗滌并離心10?20次，再真空干燥，得到二硫鍵功能化的介孔磷灰石；
[0016]步驟五中所述的羧基化的介孔磷灰石與1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽的質量比為(1.5?2.5):1 ;步驟五中所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺的質量比為1: (3?5);步驟五中所述的羧基化的介孔磷灰石的質量與PBS緩沖溶液的體積的比為Ig: (50?150)mL ;步驟五中所述的PBS緩沖溶液的摩爾濃度為0.005mol/L?0.02mol/L ;步驟五中所述的羧基化的介孔磷灰石與胱胺鹽酸鹽的質量比為1: (5?20)；
[0017]六、具有還原響應性和細胞靶向的介孔磷灰石納米藥物載體的制備:將異氰酸熒光素和步驟五得到的二硫鍵功能化的介孔磷灰石溶解于PBS緩沖溶液中，在室溫下以攪拌速度為200r/min?500r/min攪拌2.5h?3.5h，得到混合溶液B，然后將膠原蛋白、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺加入到混合溶液B中，繼續以攪拌速度為300r/min?500r/min攪拌24h?48h，得到混合溶液C，再將乳糖酸加入到混合溶液C中，繼續以攪拌速度為300r/min?600r/min攪拌12h?36h，然后用PBS緩沖液離心洗滌10?20次，再冷凍干燥，得到介孔磷灰石納米藥物載體；
[0018]步驟六中所述的異氰酸熒光素與二硫鍵功能化的介孔磷灰石的質量比為1: (3?10);步驟六中所述的異氰酸熒光素的質量與PBS緩沖溶液的體積的比為Ig: (400?800)mL ;步驟六中所述的PBS緩沖溶液的摩爾濃度為0.005mol/L?0.02mol/L ;步驟六中所述的異氰酸熒光素與膠原蛋白的質量比為(I?3):1 ;步驟六中所述的異氰酸熒光素與1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽的質量比為(1.5?4):1 ;步驟六中所述的異氰酸熒光素與N-羥基琥珀酰亞胺的質量比為1: (12?18);步驟六中所述的異氰酸熒光素與乳糖酸的質量比為1: (1.2?2.5)。
[0019]本發明的有益效果:
[0020]本發明的還原響應性靶向藥物輸送體系是一類極具前景的智能藥物傳遞體系。在正常組織細胞內，還原響應性酶(谷胱甘肽)的含量較低，但在肝癌細胞，其細胞內谷胱甘肽含量較高，是正常組織的10倍。因此，可以利用谷胱甘肽含量的不同設計智能藥物載體，實現藥物對肝癌細胞的響應性釋放。同時，肝癌細胞表面的大量受體(ASGP-R)，為藥物載體的靶向選擇提供了條件。因此，還原響應性智能藥物體系在藥物傳遞和釋放領域的應用可以極大地提高腫瘤治療的有效性。
[0021]羥基磷灰石做為人體骨骼和牙齒的重要組成，因其優異的生物相容性、生物活性和無毒性是一種重要的生物材料。通過模板法制備的介孔羥基磷灰石納米粒子具有優異的比表面積、大的孔容積和良好的生物相容性和生物降解性，藥物負載能力好，同時在體內其降解產物能被人體完全吸收，沒有毒副作用，同時其尺寸小于lOOnm，能被細胞有效地吞噬，有效地提高藥物分子對細胞的攝入效率。將乳糖酸分子修飾的膠原蛋白固定在介孔磷灰石表面，乳糖酸分子能夠特異性識別肝癌細胞表面的受體(ASGP-R)，從而實現靶向治療的目的。因此，該體系同時具有細胞靶向和還原響應性，能夠有效的控制藥物釋放，減少毒副作用，達到治愈的目的，本發明的方法具有以下優點:
[0022]1、本發明的具有還原響應性和細胞靶向的介孔磷灰石納米藥物載體能與肝癌細胞表面的配體發生特異型反應，能靶向識別肝癌細胞，減少了正常組織對藥物的攝取，降低了藥物在體內的毒副作用。
[0023]2、本發明的具有還原響應性和細胞革El向的介孔磷灰石納米藥物載體能在還原響應性酶的作用下實現定向釋放藥物分子，定時、定量的將藥物導入病變組織，有效地提高了藥物的利用率。
[0024]3、本發明的具有還原響應性和細胞靶向的介孔磷灰石納米藥物載體具有良好的生物相容性和生物降解性，細胞毒性較小，降解產物能被人體完全吸收。
[0025]4、本發明的方法操作簡單，成本低廉，實用性強。
【附圖說明】
[0026]圖1為驗證試驗(一)中介孔磷灰石納米顆粒的TEM照片；
[0027]圖2為驗證試驗(一)中試驗一得到的負載異氰酸熒光素的乳糖酸-膠原/介孔磷灰石的TEM照片；
[0028]圖3為驗證試驗(二)中在DTT刺激下試驗一得到的負載異氰酸熒光素的乳糖酸-膠原/介孔磷灰石中的模型藥物FITC的累積釋放曲線圖；其中a為沒