一種云芝多糖顆粒沖劑及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術、藥學和食品科學領域，具體涉及一種云芝多糖顆粒沖劑及 其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 云芝多糖來自液體培養的云芝菌絲體中的胞內多糖或發酵液中的胞外多糖。研 宄發現云芝多糖能降低大鼠大腦組織的脂質過氧化水平，并加速自由基的清除（Chen et al.，2013)。特別地，饒剛等人通過臨床觀察驗證了云芝多糖對高脂血癥有明顯療效，是一 種安全的制劑（饒剛，2007)。王紅等人也發現PSK有一定降血脂作用，具有一定的時效性和 改善血液的黏、凝、聚狀態（王紅，2011)云芝菌株發酵的目的是收獲菌絲體和發酵液，提取 得到云芝胞內多糖和胞外多糖，這就要求提高產量，同時現在已有發酵制備云芝胞內胞外 多糖及其產品的分離純化的最適合條件（孫靜，2012)。云芝糖肽在體內對荷瘤小鼠的免疫 調節作用可能是通過TLR4信號通路來實現的（董冰，2014);宋娟娜等在顆粒成型工藝研宄 中加入一定的輔料發現顆粒的成型性、溶解性及抗濕性都有所增強（宋娟娜等，2008)，表 明對多糖添加一定輔料，可提高多糖穩定性，降低其吸濕性。云芝多糖通常具有較強的吸濕 性，易吸收空氣中的水分，結塊、甚至霉變，從而影響藥品的質量和療效，為了降低其吸濕性 而便于儲藏，一般加入適量的輔料與之混合。目前云芝多糖顆粒沖劑產品的開發尚不多見， 本專利通過云芝多糖顆粒沖劑產品的研制，并且采用高血脂癥小鼠實驗來鑒定云芝多糖顆 粒沖劑產品的降血脂功效，為云芝多糖產品的保健應用提供科學的依據。
【發明內容】
[0003] 為了克服現有技術的不足和缺點，本發明的首要目的在于提供一種云芝多糖顆粒 沖劑，該云芝多糖顆粒沖劑制作簡單、成本低且吸濕率小、穩定性好。
[0004] 本發明的另一個目的在于提供上述云芝多糖顆粒沖劑的制備方法。
[0005] 本發明的另一個目的在于提供上述云芝多糖顆粒沖劑應用。
[0006] 本發明的目的通過下述方案實現：
[0007] -種云芝多糖顆粒沖劑，包含如下按質量百分比計的組分：
[0008] 云芝多糖提取物 4.25%?8.75 %;
[0009] β-環糊精 7.75 % ?23.25%; 糊精 46.35 % ?77.25%; 可溶性淀粉 7.75 %?23.25%; 甜蜜素 0.31 %?0.84%;
[0010] 所述的云芝多糖顆粒沖劑，優選包含如下按質量百分比計的組分：
[0011] 云芝多糖提取物 6.67%; β-環糊精 15.45%; 糊精 61.81%; 可溶性淀粉 15.45%; 甜蜜素 0.62%;
[0012] 所述的云芝多糖顆粒沖劑的制備方法，包含如下步驟：將所述的云芝多糖顆粒沖 劑的組分混合攪勻；用乙醇制成軟材；過篩，干燥，過篩整粒，制得云芝多糖顆粒沖劑；
[0013] 所述的乙醇的體積分數為60 %?80 % ;
[0014] 所述的過篩是過14?40目篩；
[0015] 所述的干燥溫度為55?60°C ;
[0016] 所述的干燥溫度優選為55°C ;
[0017] 所述的云芝多糖提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0018] (1)云芝（Coriolus versicolor)液體深層發酵后，分離得到云芝菌絲體和發酵 液，其中，云芝菌絲體干燥粉碎并過篩后脫脂，干燥，得到脫脂后的菌絲體；發酵液超濾去除 小分子物質，得到云芝超濾液；
[0019] (2)熱水浸提脫脂后的菌絲體，得到含云芝胞內多糖的浸提液；
[0020] (3)將步驟（1)得到的云芝超濾液和步驟（2)得到的浸提液分別濃縮，得到超濾濃 縮液和浸提濃縮液；
[0021] (4)步驟⑶制備得到的超濾濃縮液和浸提濃縮液分別加入乙醇沉降多糖，待析 出粗多糖，離心得到沉淀；先醇沉再去蛋白可以節約試劑和減少多糖損失；
[0022] (5)用水分別溶解步驟⑷制得的沉淀，并調節多糖溶液pH至7. 5?8. 5,采用胰 蛋白酶和Sevage法去蛋白，分別得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞內多糖提取液；
[0023] (6)分別調節步驟（5)中制得的去蛋白后的胞外多糖提取液和胞內多糖提取液pH 至7. 5?8. 0,滴加質量分數為30%的H2O2，在50?55 °C水浴保溫2?3h，對其進行氧化脫 色處理；將脫色后的胞外多糖提取液和胞內多糖提取液裝入截留分子量為8000?15000Da 的透析袋中以蒸餾水透析2?3d，每8?IOh更換一次蒸餾水；對透析完成后的溶液進行 濃縮，并真空冷凍干燥，分別制得云芝胞外多糖提取物和云芝胞內多糖提取物；
[0024] 步驟（1)中所述的云芝菌絲體干燥溫度優選為50?55°C ;所述的過篩篩目為 14?40目，優選為40目；
[0025] 步驟⑴中所述的脫脂方法優選為：以菌絲體粉末與石油醚按體積比1:2混勾，振 蕩或攪拌處理2?3d，脫去菌絲體中的脂質，離心留沉淀；重復脫脂1?2次；
[0026] 步驟（1)中所述的超濾條件優選為進膜壓力為lObar，通量3?5L/min，物料溫度 22°C ;所述的超濾優選用1萬分子量PS超濾膜超濾；
[0027] 步驟⑵中所述的熱水浸提云芝多糖時，料液比為1:30,提取時間為2?3h，提取 溫度為90°C，提取次數為1?3次；
[0028] 步驟（3)中所述的濃縮的溫度優選為55°C?60°C ;優選為60°C ;
[0029] 步驟（4)中所述的乙醇用量為超濾濃縮液或浸提濃縮液體積的3?5倍；
[0030] 步驟⑷中所述的沉降溫度為0?8 °C，沉降的時間為48?72h ;
[0031] 步驟（5)中所述的質量分數為30%的H2O2用量為每IOOmL多糖提取液加2mL的 質量分數為30 %的H2O2;
[0032] 步驟（5)中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步驟：
[0033] ①將胰蛋白酶加入多糖溶液中充分混合并37 °C?40 °C振蕩30?60min，再水浴滅 酶10?15min，冷卻至室溫；
[0034] ②加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液，劇烈振蕩30?40min ;然后離心，棄取蛋 白層及有機溶液，回收上清液；
[0035] ③重復步驟②2?3次，得到去蛋白后的多糖提取液；
[0036] 步驟①中所述的胰蛋白酶的初始濃度優選為2% (W/V);所述的胰蛋白酶的用量 為多糖溶液體積的8%?15% ;所述的滅酶溫度優選為100°C?IKTC ;
[0037] 步驟①中所述的將胰蛋白酶加入多糖溶液中充分混合的具體操作優選為：配制 2% (W/V)胰蛋白酶溶液，將胰蛋白酶溶液和多糖溶液分別35 °C?40 °C水浴預熱10? 15min，然后將預熱后的胰蛋白酶溶液和多糖溶液充分混合；
[0038] 步驟②所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的體積比為5:1 ;
[0039] 步驟②所述的離心轉速為8000?lOOOOrpm，所述的離心時間為10?15min ;
[0040] 步驟（1)中所述的云芝（Coriolus versicolor)液體發酵的方法，包含如下步驟：
[0041] ( I )將云芝斜面母種活化培養后轉接至斜面固體培養基中，24?27°C培養10? 15d，直至菌絲鋪滿斜面為止，得到云芝斜面菌種；
[0042] ( II )從步驟（I )制備得到的云芝斜面菌種上挑取4?6菌塊，接種至200mL的 液體發酵培養基中，室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后，在150rpm，27的條件下振蕩培養 6d，制得一級種子液；
[0043] (III)將步驟（II )制備得到的一級種子液轉入50L種子罐培養二級種子液，接種 量為7 %，培養溫度為27°C，轉速為150rpm，罐壓為0. 05?0. 07MPa，通氣量I. 5m3/h (V: V為 1:0. 6)，培養3d后轉入500L發酵罐培養，初始培養條件溫度，轉速及罐壓與種子罐相同，通 氣量為12m3/h，培養3?5d ;
[0044] 步驟（I )所述的斜面固體培養基的配方為：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋 白胨 lg，（NH4) 2S042g，MgSO4 · 7H20 lg，KH2PO4Ig,瓊脂 20g，加蒸餾水定容至 lOOOmL，pH 調至 6. 5 ；
[0045] 步驟（II )和（III)中用于一級種子液和二級種子液培養以及發酵培養的培養 基配方為：步驟（1)中所述的云芝液體深層發酵的培養基配方為：葡萄糖50g，NH 4N032g， KH2P042g，MgSO4 · 7H20 lg，維生素 B1O. 05g，水 1000mL，pH 6· 5 ;
[0046] 一種云芝多糖提取物，根據上述制備方法制備得到；
[0047] 所述的云芝胞內多糖提取物（IPCV)中總糖、還原糖、蛋白質含量分別為 66. 83%?69. 93%，3· 22%?3. 88%，0· 17%?0· 33% ;云芝胞外多糖提取物（EPCV)中總 糖、還原糖、蛋白質含量分別為66. 29%?68. 16%，3· 53%?4. 87%，0· 21%?0· 35% ;
[0048] 本發明制備得到云芝多糖顆粒沖劑具有良好的降血脂作用，顯著降低動脈粥樣硬 化指數，具有抗動脈粥樣硬化的能力；
[0049] 所述的云芝多糖顆粒沖劑在降血脂藥物與保健食品應用中的使用劑量為 2998. 5mg/kg · d (含 200mg/kg · d 云芝多糖提取物）。
[0050] 本發明以云芝多糖提取物為主要原料，并添加一定的輔料，其中輔料應具有良好 的流動性，吸濕性低、易成型，有潤濕性，有利于崩解與溶出，不影響指標成分的溶出，不與 指標成分相互作用，且不影響療效，以可溶性淀粉、糊精等為輔料效果較好，該顆粒沖劑乳 白色，易溶于水。在外觀、融化性具有良