H值，使溶液呈堿性環境。其次，將2mLMA緩慢加入以上溶液中，以0.2mL/min—
0.5mL/min的速率，緩慢滴加的同時，注意控制整個反應體系的PH值，用5MNa0H來調節，使整個反應體系的PH穩定在7.4-8之間，用精密PH試紙判斷。第三，反應3小時之后，透析，所用透析袋的截留分子量為lKDa，透析5-7天，透析溶劑為水，以除去多余未反應MA，透析溫度設定為50°C。第四，凍干。第五，避光保存。
[0032]所用乙烯基化改性試劑還可為戊酐、丙烯酸酐、馬來酸酐中的一種。
[0033]改性的帶有氨基和羧基的生物可降解高分子材料巰基化明膠的制備
取5g明膠粉末，溶于500mLPBS溶液中，用5MNaH2P0jP 5MNa0H來調節PH，使得體系中PH值穩定在4.71—4.81。加入EDC1.9871g，NHS0.3683g，混合均勻，以鼓泡形式通氮氣20-30min以除氧。隨后,迅速加入半胱胺(Cysteamine)0.6712g,繼續通氮氣鼓泡。攪拌反應12h，控制反應溫度為37°C。將反應產物旋蒸，透析，以水為透析液，透析時在透析液中加入少量的EDTA (0.2mmol/L)抑制端巰基氧化。透析5_7天。旋蒸，凍干，避光保存。
[0034]紫外光固化交聯取200mg制備所得的乙烯基化明膠溶于ImLPBS溶液中；取10mg制備所得的巰基化明膠溶于50mLPBS溶液中，此溶解過程通氮氣鼓泡15分鐘；稱取50mg2_羥基-4’ - (2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(12959)溶于lmL75%乙醇溶液中；將溶解好的乙烯基化明膠與巰基化明膠混合，量取7.5uL12959乙醇溶液添加到混合液中，渦旋震蕩3min ;取150uL混合液澆鑄于模具中，置于紫外光下，輻照20s — 3min ;取出，得到交聯組織工程支架材料；保存于PBS溶液中，4°C條件下儲存。所述模具腔體規格為:(M5mmX100um、(M5mmX200um。所述紫外光強度為50-300mmW。
[0035]將紫外光固化交聯所得的支架用含雙抗的PBS溶液浸泡滅菌24小時，將其平鋪于 24 孔板中，用完全培養基(90% F12:DMEM = 1:1,10% FBS, 1% ant1-anti, 5 μ g/mLinsulin, lOng/mLEGF)進行預培養24小時以除去雜質，將小鼠成纖細胞(1929)種植于支架材料上，體外靜態培養7天后電鏡觀察及MTS測試分析，如圖4所示，見細胞能在支架上良好生長，且細胞存活率高達70%以上。
[0036]取第一步所得乙烯基化明膠lOOmg，溶于ImLPBS溶液中；取第二步所得巰基化明膠50mg，溶于500uLPBS溶液中；將兩溶液分別置于100°C沸水中煮5min。無菌條件下，將兩者混溶，添加0.5%的12959乙醇溶液，充分混合。取10uL混合物，將其與1929細胞混合，細胞濃度為20000個/孔，渦旋震蕩2min ;添加到96孔板中。置于365nm紫外光下輻照lmin。培養24小時，通過死活檢測裝置檢測發現，細胞在該組織工程支架材料上存活率聞達90%以上。
[0037]預先用熒光染料DilC(3)對1929細胞進行著色處理；取第一步所得乙烯基化明膠150mg，溶于ImLPBS溶液中；取第二步所得巰基化明膠75mg，溶于500uLPBS溶液中；將兩溶液分別置于100°C沸水中煮5min。無菌條件下，將兩者混溶，添加0.5%的12959乙醇溶液，充分混合。取10uL混合物，將其與經過著色處理的1929細胞混合，細胞濃度為20000個/孔，渦旋震蕩2min ;添加到96孔板中。置于365nm紫外光下輻照lmin。然后分別培養1、4、7天后，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞在材料三維生長情況，如圖5所示，見細胞在組織工程支架材料上生長良好。
[0038]【具體實施方式】只用于對本發明進行進一步說明，不能作為對本發明保護范圍的限定，同時該領域的技術人員根據上述發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整，都位于本發明的保護范圍內，本發明的保護范圍以權利要求書為準。
【主權項】
1.一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料，其特征在于:所述的組織工程支架材料為基于乙稀基_疏基交聯的網狀結構。
2.根據權利要求1所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料，其特征在于:所述的組織工程支架材料原料為帶有氨基和羧基的生物可降解高分子材料。
3.一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:對原料分別用乙烯基化改性試劑和巰基化改性試劑進行乙烯基化改性處理和巰基化改性處理，再將經過乙烯基化改性處理和巰基化改性處理的原料充分混合并在紫外燈輻照下進行光固化交聯。
4.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的乙烯基化改性試劑為甲基丙烯酸酐、戊烯酸酐、丙烯酸酐、馬來酸酐中的一種。
5.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的乙烯基化改性處理的反應溫度為50°C，反應環境為堿性條件，PH值控制在7.4—8之間。
6.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的乙烯基化改性處理的原料溶液濃度為5% — 20%w/v。
7.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的乙烯基化改性試劑的添加速率為0.2mL/min一0.5mL/min,添加量為 0.5%—1.5%v/v。
8.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的巰基化改性處理的原料液濃度為0.5% — 2.0% w/v。
9.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的巰基化改性處理反應體系PH值穩定控制在4.71—4.81。
10.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的巰基化改性處理反應溫度為37°C。
11.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的巰基基化改性試劑為半胱胺。
12.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的乙烯基化改性原料與巰基化改性原料混合的質量比為2:1。
13.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的巰基化改性原料在混合前要經過通氮排氧處理。
14.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的光固化交聯添加的光引發劑為12959型光引發劑，添加量為0.1%—1.0% w/vo
15.根據權利要求3所述的一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述的紫外光輻照強度為50-300mW，輻照時間為20s — 3min。
【專利摘要】本發明涉及一種基于乙烯基-巰基交聯的組織工程支架材料及其制備方法。所述巰基-乙烯基交聯反應具有低氧敏感性，可光引發等特性；制備得到的多孔凝膠材料具有可生物降解性、空間可控性、無細胞毒性，滿足生物細胞生長的要求，并且具有良好的機械性能，適用于組織工程用支架材料；通過該法可實現對組織工程進行按需治療；所述組織工程材料制備方法簡單易行，原料來源廣泛，制備過程綠色環保，無污染。
【IPC分類】C08J3-24, C08J3-28, A61L27-50, A61L27-16
【公開號】CN104548196
【申請號】CN201410751589
【發明人】李玲琍, 蒂姆·查爾斯·休斯, 郝曉娟, 陳浩, 王磊
【申請人】溫州醫科大學附屬眼視光醫院, 溫州生物材料與工程研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月10日