自發性腦出血動物模型平臺及其在藥物篩選中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及疾病和藥物研究領域。具體的，本發明提供了一種研究自發性腦出血 的動物模型平臺，以及使用所述動物模型平臺篩選自發性腦出血藥物的方法。
【背景技術】
[0002] 自發性腦出血（Spontaneous intracerebral hemorrhage, ICH)是指非外傷情況 下各種原因引起的腦大、小動脈，靜脈和毛細血管自發性破裂引起的腦內出血。ICH是一種 多因素疾病，受環境和遺傳因素共同作用。其癥狀包括意識障礙、偏癱、失語、蛛網膜下腔出 血、視力下降、視網膜出血等。其發病原因包括高血壓，淀粉樣變性血管病、先天性血管瘤、 動靜脈畸形、凝血障礙等以及煙霧病、結節性多動脈炎、抗凝劑和抗血小板聚集劑的應用和 某些藥物的使用。在歐美國家，自發性腦出血患者占全部卒中患者的10%?20%，病死率和 致殘率都很高，有資料顯示病死率達23%?52%。在我國，根據2005年中國腦血管病防治指 南，腦出血發病率為60?80/10萬人口 /年，占全部卒中病例的30%左右，急性期病死率約 為30%?40%。大腦半球出血約占80%，腦干和小腦出血約占20%。至于復發性腦出血的發 生率，根據國外資料，亞洲國家為1. 8%?11%，歐洲國家為6%?24%，拉丁美洲為6%?30%。
[0003] 自發性腦出血已通過各種動物模型得到復制并深入機制研究。在ICH的行為學研 究中，其研究方法包括化學性損害模型，機械損傷模型和基因遺傳模型。化學性損害模型包 括用膠原酶或自體血注入等方法對動物例如靈長類或嚙齒類動物進行處理。膠原酶介導建 立的動物模型是常見的ICH模型之一，能很好地模擬ICH的臨床癥狀和病理學特點。不同 的ICH致病模型模擬的ICH的病理、發病機制、臨床癥狀和病理學特點不同。不同的動物在 同一個ICH致病模型也有一定區別。例如，不同動物對膠原酶敏感性有差異。因此通常需 要針對特定的醫學或藥物開發研究目的開發特定的ICH致病模型，以及選擇特定的動物類 型，以及觀察這種特定動物模型的特定參數，才能盡量準確地獲得待測醫療手段或藥物是 否對ICH有效的判斷。
[0004] 應用于檢測ICH模型中行為學檢測方法主要有：前肢上抬實驗、伸爪實驗、圓柱體 實驗、改良神經功能缺損評分（mNSS)、轉角實驗等。數十年來上述行為學檢測方法被用于檢 測中樞神經系統損傷后的感覺功能研究。然而，這些方法被用于評估單方面功能障礙時，有 許多限制。例如，前肢上抬實驗和改良神經功能缺損評分需要固定大鼠軀干；圓柱體實驗僅 測試前肢，后肢則被忽視。很少有研究測試了動物單側腦出血情況下的不對稱感覺以及運 動功能障礙。
[0005] ICH患者可能會需要數年時間來恢復長期腦功能障礙。臨床研究的目的就是改善 人類的功能恢復。目前大多使用ICH的動物模型來模擬臨床情況。盡管障礙表現可以非常 接近ICH癥狀，但用現今的研究技術進行微創檢測發現，通常動物經過最初的腦出血之后 約2個月即可幾乎完全恢復。很少有研究進行長期性功能障礙的評估。
[0006] 因此，顯然還需要一種對ICH短期和長期功能障礙和癥狀敏感的可重復性高的方 法，來評估腦出血后單側中樞神經混亂和其回復過程造成的的損傷程度和長期殘余損傷， 特別是膠原酶誘導的ICH大鼠模型的行為狀態判斷方法以及使用這種方法評估藥物或療 法對ICH的效果。
[0007] 因此，本報告的目的，即是對步態參數進行探索性分析來確定這些ICH大鼠模型 的變化，并通過對ICH大鼠的步態分析探索其長期障礙表現。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了一種用于研究自發性腦出血（ICH)的動物模型平臺，所述模型平臺 利用膠原酶（Collagenase)誘發大鼠出現ICH癥狀，并采用定量分析大鼠通過步行臺的步 態及姿勢指標來作為檢測ICH行為學檢測的特征參數。本發明還提供的利用所述平臺用作 在待測物中研究或篩選ICH相關藥物的方法。
[0009] 具體的，本發明提供了一種用于制備自發性腦出血動物模型的方法，包括以下步 驟：
[0010] (1)對大鼠進行訓練，包括將大鼠放入步行臺，讓其從步行臺一側跑至另一側，訓 練至大鼠能連續地通過步行臺，
[0011] (2)對步驟（1)得到的大鼠進行誘發模擬自發性腦出血癥狀的處理；
[0012] (3)短期或長期觀察和定量分析步驟（3)得到的大鼠通過步行臺的步態指標；
[0013] (4)根據（3)的分析結果對所述大鼠的ICH的疾病程度和恢復狀況進行判斷。
[0014] 在本發明的其中一個方面，其中所述自發性腦出血動物模型用于自發性腦出血的 長期和短期研究。
[0015] 在本發明的其中一個方面，其中所述方法中的步驟（1)為將大鼠放入步行臺，讓其 自由從通道一側自由跑至另一側，訓練合格的大鼠為在沒有推拉的狀態下通過走道。優選 的，以大鼠至少可以連續三次正確地無停頓地通過通道為訓練合格條件。更優選的，以大鼠 至少可以連續三次正確地無停頓地在1. 0-2. 5秒內通過通道為訓練合格條件。
[0016] 在本發明的其中一個方面，其中所述方法中的步驟（2)所述誘發模擬自發性腦出 血癥狀的處理為將膠原酶(例如IV型膠原酶）施用于大鼠腦半球的紋狀體。可選擇施用于 大鼠一側或兩側腦半球的紋狀體。造成的腦部損傷通常反映在對側肢體受損（例如運動功 能等受:損）。
[0017] 在本發明的其中一個方面，其中所述大鼠通過步行臺的步態指標包括靜態指標和 /或動態指標。靜態指標可包括爪印面積、最大接觸面積、接觸時間、接觸平均強度、最大接 觸平均強度或其任意組合。動態指標可包括行走時間，速度變異率，步頻，搖擺速度，步幅， 接觸率、占空比、支撐比例類型、爪間距離、步伐周期或其任意組合。
[0018] 在本發明的其中一個方面，其中所述方法中的步驟（3)中為短期觀察和定量分析。 短期可以是指在對步驟（2)進行模擬自發性腦出血癥狀的處理后1天到30天內（例如在第 1-3天，優選在第3天)。觀察和分析的步態指標為爪印面積、最大接觸面積、前爪接觸時間、 壓力、搖擺速度、后爪占空比、步幅、前爪間距、支撐比例類型例如三爪支撐模式、步頻和平 均速度中的一種或多種的組合。在本發明的其中又一個方面，步驟（3)中當出現：
[0019] (a)前肢和/或后肢爪印面積變小；
[0020] (b)前爪接觸時間上升；
[0021] (C)壓力變小；
[0022] (d)后爪搖擺速度下降；
[0023] (e)后爪占空比下降；
[0024] (f)步幅下降；
[0025] (g)前爪間距下降；
[0026] (h)三爪支撐模式比例上升；
[0027] (i)步頻下降；或
[0028] (j) (a)_ (i)中的任意兩種或多種的組合時，
[0029] 判斷為大鼠的對側腦部受損。
[0030] 在本發明的其中一個方面，其中所述方法中的步驟（3)中為長期觀察和定量分析。 長期一般是指在對步驟（2)進行模擬自發性腦出血癥狀的處理后1天到60天內（例如在第 1-56天內，優選在第1，3, 28, 35和56天)。觀察和分析的步態指標包括爪印面積、最大接觸 面積、前爪接觸時間、壓力、搖擺速度、后爪占空比、步幅、前爪間距、支撐比例類型例如三爪 支撐模式、步頻和平均速度中的一種或多種的組合，優選為爪印面積、站立期持續時間和壓 力方面的一種或多種的組合。在本發明的其中又一個方面，其中步驟（3)中當在出現：
[0031] (a)前肢和/或后肢爪印面積變小；
[0032] (b)前爪接觸時間與另一側前爪接觸時間的比值上升；
[0033] (C)后爪接觸時間與另一側后爪接觸時間的比值下降；
[0034] (d)壓力下降；
[0035] (e)步幅下降；
[0036] (f)前爪間距下降；
[0037] (g)三爪和四爪支撐模式出現的比例增多，雙爪和單爪支撐模式出現的比例減少