一種新的治療肺癌的Der p1納米疫苗及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及新型疫苗發明領域，具體地說是一種新的治療肺癌的Derpi納米疫苗 及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 肺癌已經成為全球范圍內所有癌癥發病率的首位，其五年存活率大約為15%，約 30-40%的肺癌患者發生骨轉移，一旦發生骨轉移，其中位生存時間只有7個月。美國2012 年肺癌有超過163萬新發病例及57萬死亡病例。肺癌同時也超過肝癌成為了我國第一大 高發癌癥，且發病率及死亡率增長最為迅速，每年以13%的速度增長。目前，肺癌占據癌癥 發病率排行(男女綜合）的首位，其中在男性發病率中排第一，在女性癌癥發病率中也始終 排在前三位。預計到2025年，中國每年新增肺癌病例將超過100萬例。肺癌患者還呈現年 輕化趨勢，尤其是近幾年來，45歲以下的肺癌患者多有出現。因此，肺癌已經嚴重影響威脅 我國人民的生命健康。
[0003]目前治療方法主要有手術治療、化療、放療等方法。縱觀目前的療法，手術治療主 要適合早中期（i~ii期）肺癌和腫瘤局限在一側胸腔的部分選擇性的mb期肺癌，和放療 同屬局部治療，從腫瘤生物學角度看，癌癥是全身性疾病，存在轉移和擴散的特性；常規的 放療和化療等治療方式，在殺死腫瘤細胞的同時也損傷機體正常細胞和免疫系統，降低免 疫力，毒副作用大。因此，開展新的抗癌藥物的研發重要且必要，尋找對抗癌效果好且對正 常組織毒害小、不損害機體免疫的藥物的確迫切需求。經過我們發明人前期研究表明，屋塵 螨Derpi疫苗對肺癌的治療有著顯著的作用，且能增強機體免疫能力，具有抗癌功能。
[0004] 本發明采用基因工程技術在大腸桿菌中克隆和表達制備重組Derpi蛋白，克服了 從螨體中大量提取的困難。同時采用PLGA納米佐劑制備塵螨重組變應原Derpi疫苗，用 于治療肺癌。本發明國內外尚未見報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的之一是克服現有技術的上述不足，而提供一種新的治療肺癌的Der pl納米疫苗。
[0006] 實現本發明上述發明目的的技術方案是：一種新的治療肺癌的Derpl納米疫苗， 其是采用如下步驟制備而成的： 步驟一，用基因工程技術制備重組屋塵螨變應原Derpl: (1)挑取單個含重組表達質粒重組pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接種于含 50iig/ml卡那霉素的LB中，35~37°C，160~240rpm搖菌過夜，按1~4%的接種量將基因工程 菌菌落接種于LB/kam培養液中，200~300rpm搖菌至0D600為0. 5~0. 7時，加入IPTG使其 終濃度為〇.l~〇. 4mM，誘導4~6小時后，2000~4000g在2~6°C離心5~15min，去上清，沉淀用 lxPBS洗滌，將細菌重懸于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至終濃度0. 4~0. 6mg/ml， DIT至終濃度 5~15mM，PMSF至終濃度 0? 8~1. 2mmol/L，TritonX-100 至終濃度 0? 8~1. 2%， 并于室溫中振蕩20~40分鐘，制成基因工程菌培養物裂解液，-80°C保存； (2) 將裂解液置于冰浴下40W超聲5~15遍，超聲20~40s、停20~40s，直至菌體不粘為 止，10000~12000g3~5°C離心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵體； (3) 在冰浴下，用100ml包涵體洗液1重懸沉淀，并磁力攪拌20~40min, 10000~12000g3~5°C離心10~20min，去上清，再依次用包涵體洗液2和包涵體洗液3重懸， 冰浴磁力攪拌，離心去上清，最后將沉淀溶于20ml包涵體溶解液中，10000~12000g離心 30min，棄沉淀，得包涵體； 由于重組蛋白N-端帶有6-His標簽，故通過Ni2+金屬螯合層析進行重組Derpi親和 層析純化，得重組屋塵螨變應原Derpi; 步驟二，制備PLGA-塵螨應變原Derpi(PLGA-Derpi)納米疫苗： 稱50mgPLGA溶于二氯甲烷中，再加入100iiL已制備好的濃度為100mg/ml的重組屋塵 螨應變原Derpl，混旋lmin，40w，超聲乳化1min形成初乳液，再加入2ml濃度為2%的聚 乙烯醇（PVA)，再超聲乳化1~2min，形成復乳液，然后將復乳液轉移至50ml的雙蒸水中，室 溫下攪拌3~5h，使有機溶劑充分揮發，lOOOOrpm/min離心lOmin，離心收集微粒，再用雙蒸 水洗滌，最后真空冷凍干燥成微粒粉末狀的PLGA-塵螨變應原Derpi納米疫苗，4°C保存。
[0007] 優選地，所述步驟一（1)中的基因工程菌菌落接種量為2%;搖菌至終濃度為 0? 2mM;PMSF至終濃度為lmmol/L;TritonX-100 至終濃度為 1%。
[0008] 優選地，所述步驟一（3)中的包涵體洗液1為50mmol/LPBPH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/LEDTA;包涵體洗液 2 為 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 2%TritonX-100;包涵體洗液 3 為 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 4mol/L尿素；包涵體溶解液為 50mmol/LPBPH8. 0,300mmol/LNacl，20mmol/L咪唑，6mol/ L尿素。
[0009]優選地，所述步驟二中的PLAG為LA:GA=65:35,Mw=40000-75000。
[0010] 本發明的目的之二是克服現有技術的上述不足，而提供一種新的治療肺癌的Der pl納米疫苗的制備方法。
[0011] 實現本發明上述發明目的的技術方案是：一種新的治療肺癌的Derpl納米疫苗 的制備方法，其步驟如下： 步驟一，用基因工程技術制備重組屋塵螨變應原Derpl: (1) 挑取單個含重組表達質粒重組pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接種于含 50iig/ml卡那霉素的LB中，35~37°C，160~240rpm搖菌過夜，按1~4%的接種量將基因工程 菌菌落接種于LB/kam培養液中，200~300rpm搖菌至0D600為0. 5~0. 7時，加入IPTG使其 終濃度為〇.l~〇. 4mM，誘導4~6小時后，2000~4000g在2~6°C離心5~15min，去上清，沉淀用 lxPBS洗滌，將細菌重懸于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至終濃度0. 4~0. 6mg/ml， DIT至終濃度 5~15mM，PMSF至終濃度 0? 8~1. 2mmol/L，TritonX-100 至終濃度 0? 8~1. 2%， 并于室溫中振蕩20~40分鐘，制成基因工程菌培養物裂解液，-80°C保存； (2) 將裂解液置于冰浴下40W超聲5~15遍，超聲20~40s、停20~40s，直至菌體不粘為 止，10000~12000g3~5°C離心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵體； (3) 在冰浴下，用100ml包涵體洗液1重懸沉淀，并磁力攪拌20~40min, 10000~12000g3~5°C離心10~20min，去上清，再依次用包涵體洗液2和包涵體洗液3重懸， 冰浴磁力攪拌，離心去上清，最后將沉淀溶于20ml包涵體溶解液中，10000~12000g離心 30min，棄沉淀，得包涵體； 由于重組蛋白N-端帶有6-His標簽，故通過Ni2+金屬螯合層析進行重組Derpi親和 層析純化，得重組屋塵螨變應原Derpi; 步驟二，制備PLGA-塵螨應變原Derpi(PLGA-Derpi)納米疫苗： 稱50mgPLGA溶于二氯甲烷中，再加入100iiL已制備好的濃度為100mg/ml的重組屋塵 螨應變原Derpl，混旋lmin，40w，超聲乳化1min形成初乳液，再加入2ml濃度為2%的聚 乙烯醇（PVA)，再超聲乳化1~2min，形成復乳液，然后將復乳液轉移至50ml的雙蒸水中，室 溫下攪拌3~5h，使有機溶劑充分揮發，lOOOOrpm/min離心lOmin，離心收集微粒，再用雙蒸 水洗滌，最后真空冷凍干燥成微粒粉末狀的PLGA-塵螨變應原Derpi納米疫苗，4°C保存。
[0012] 優選地，所述步驟一（1)中的基因工程菌菌落接種量為2%;搖菌至終濃度為 0? 2mM;PMSF至終濃度為lmmol/L;TritonX-100 至終濃度為 1%。
[0013] 優選地，所述步驟一（3)中的包涵體洗液1為50mmol/LPBPH8. 0，100mmol/L Nacl，5mmol/LEDTA;包涵體洗液 2 為 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 2%TritonX-100;包涵體洗液 3 為 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 4mol/L尿素；包涵體溶解液為 50mmol/LPBPH8. 0,300mmol/LNacl，20mmol/L咪唑，6mol/ L尿素。
[0014]優選地，所述步驟二中的PLAG為LA:GA=65:35,Mw=40000-75000。
[0015] 本發明的目的之三是克服現有技術的上述不足，而提供一種新的治療肺癌的Der pl納米疫苗的用途。
[0016] 實現本發明上述發明目的的技術方案是：一種新的治療肺癌的Derpl納米疫苗， 用于治療肺癌。
[0017] 本發明與現有技術相比具有如下優點：本發明的一種新的治療肺癌的Derpl納 米疫苗，具有良好的抗癌功能，對肺癌有著顯著的治療效果，既對人體無毒害作用，還能增 加機體免疫能力，且制備工藝簡單。
[0018] 以下通過具體實施例對本發明作進一步描述。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1 : 一種新的治療肺癌的Derpl納米疫苗，其是采用如下步驟制備而成的： 步驟一，用基因工程技術制備重組屋塵螨變應原Derpl: (1)挑取單個含重組表達質粒重組pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接種于20ml含50iig/ml卡那霉素的LB中，35°C，160rpm搖菌過夜，按1%的接種量將基因工程菌菌 落接種于1LLB/kam培養液中，200rpm搖菌至0D600為0. 5時，加入IPTG使其終濃度為 0.ImM，誘導4小時后，2000g在2°C離心5min，去上清，沉淀用lxPBS洗滌一遍，將細菌重懸 于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至終濃度0. 4mg/ml，DTT至終濃度5mM，PMSF至終 濃度0. 8mmol/L，TritonX-100至