一種含氟脂質(zhì)納米顆粒的制備方法及應(yīng)用

本發(fā)明涉及納米藥劑，具體涉及一種含氟脂質(zhì)納米顆粒的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、核酸是生物體行使生命活動的重要成分之一。外源性核酸進入細胞后，可以表達編碼蛋白用于治療疾病或作為疫苗激活機體免疫系統(tǒng)。然而外源性核酸易被體內(nèi)廣泛存在的核酸酶降解，因此難以發(fā)揮其生物學效應(yīng)(k.paunovska,d.loughrey?and?j.e.dahlman,nat.rev.genet.,2022,23,265–280.)。其次，核酸分子親水且表面帶強烈的負電荷，這些特點使其難以跨過細胞膜。因此核酸藥物需要依賴載體賦予其穩(wěn)定性并將其輸送至細胞中發(fā)揮作用。脂質(zhì)納米顆粒(lnp)是目前應(yīng)用最為廣泛的核酸載體之一。由moderna和pfizer/biontech公司分別研制的兩種新冠核酸疫苗證明了lnp載體優(yōu)秀的功效和良好的安全性。

2、lnp載體由可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇(peg)脂質(zhì)組成。在這些成分中，可電離脂質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)顯著影響核酸的輸送效率?？呻婋x脂質(zhì)在酸性緩沖溶液中帶正電，與帶負電的核酸分子相互作用形成lnp。在生理ph環(huán)境下，lnp呈無電荷狀態(tài)，這可以避免全身循環(huán)的快速清除。當lnp進入細胞溶酶體后，可電離脂質(zhì)重新轉(zhuǎn)為帶負電狀態(tài)以促進核酸的釋放(k.j.kauffman,j.r.dorkin,j.h.yang,m.w.heartlein,f.derosa,f.f.mir,o.s.fenton?and?d.g.anderson,nano?lett.,2015,15(11),7300–7306.)。盡管目前已經(jīng)開發(fā)了多種毒性和免疫原性較低的可電離脂質(zhì)，研發(fā)具有更高輸送效率的新電離脂質(zhì)仍是十分必要的。

3、研究發(fā)現(xiàn)，氟化脂質(zhì)、樹突狀脂質(zhì)和聚合物可以提高核酸遞送能力。這主要歸因于氟化脂質(zhì)的獨特特性。與碳氫化合物相比，氟碳化合物具有疏水性、疏脂性和更好的穩(wěn)定性，這使其更容易自組裝。已有研究表明，氟化脂質(zhì)或聚合物能形成更穩(wěn)定的lnp，從而防止封裝核酸的降解以延長血液循環(huán)時間(z.zhang,w.shen,j.ling,y.yan,j.hu?andy.cheng,nat.commun.,2018,9,1377.)。因此研發(fā)新的氟化可電離脂質(zhì)可能是提高lnp核酸輸送效率的有效策略。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于上述情況，本發(fā)明的目的之一在于提供一系列含氟脂質(zhì)納米顆粒的制備方法，本發(fā)明的目的之二在于提供所述的含氟lnp用于提高核酸遞送效率的應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了一種含氟脂質(zhì)納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

3、步驟(1)：乙醇相脂質(zhì)溶液的配制：將含氟脂質(zhì)與可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇脂質(zhì)溶于無水乙醇中，混合均勻，得到乙醇相脂質(zhì)溶液；

4、所述可電離脂質(zhì)為十七烷-9-基-8-((2-羥乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯)或4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亞油基)甲酯或((4-羥基丁基)氮雜二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)；

5、步驟(2)：水相核酸溶液的配制：將核酸分子溶解于檸檬酸緩沖液，得到水相核酸溶液；

6、步驟(3)：含氟脂質(zhì)納米顆粒的制備：將步驟(1)配制的乙醇相脂質(zhì)溶液與步驟(2)配制的水相核酸溶液混合，混合物使用脫鹽層析柱進行純化，純化后的產(chǎn)物為含氟脂質(zhì)納米顆粒(其水合粒徑在10～500nm)；

7、步驟(1)中所述含氟脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下所示：

8、其中，rf選自全氟叔丁氧基三氟乙氧基二氟乙氧基五氟硫基芐氧基單氟代芐氧基二氟芐氧基等氟代芐氧基、雙三氟甲基芐氧基三氟甲氧基芐氧基三氟甲硫基芐氧基和具有o(ch2)2(cf2)mcf3結(jié)構(gòu)的直鏈多氟烷基中任一種，m＝1-10的自然數(shù)，n＝3-20的自然數(shù)。

9、進一步的，所述可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇脂質(zhì)為以下配方中的任意一種；

10、配方一：十七烷-9-基-8-((2-羥乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯)、二硬脂?；字Ｄ憠A、膽固醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000；

11、配方二：4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亞油基)甲酯、二硬脂?；字Ｄ憠A、膽固醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000；

12、配方三：((4-羥基丁基)氮雜二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)、二硬脂?；字Ｄ憠A、膽固醇和甲氧基聚乙二醇雙十四烷基乙酰胺。

13、進一步的，步驟(1)中所述的含氟脂質(zhì)的制備方法包括以下步驟：

14、步驟(a)：堿存在的條件下，將含氟醇轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的鉀鹽或鈉鹽得到含氟親核試劑1；

15、步驟(b)：含氟親核試劑1與單鹵代的烷基醇發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到氟化烷基醇2；

16、步驟(c)：在氟化烷基醇2中加入活化劑、縛酸劑1進行活化，得到活化的氟化烷基醇3；

17、步驟(d)：在縛酸劑2、催化劑1存在條件下，將活化后的氟化烷基醇3與芐胺反應(yīng)，得到芐基保護的含氟脂質(zhì)4；

18、步驟(e)：最后在氫氣氛圍、催化劑2下，脫去芐基保護的含氟脂質(zhì)4中的芐基保護基，得到含氟脂質(zhì)，合成路線如下所示：

19、

20、進一步的，步驟(a)所述的含氟醇為全氟叔丁醇、三氟乙醇、二氟乙醇、五氟硫基芐醇、氟代芐醇、雙三氟甲基芐醇、三氟甲氧基芐醇、三氟甲硫基芐醇中任一種，堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述堿與含氟醇的摩爾比為1:1。

21、進一步的，步驟(b)中含氟親核試劑1與單鹵代的烷基醇的物質(zhì)的量之比為1.0：(1.1～3.0)，所述單鹵代的烷基醇為12-溴-1-十二烷醇；所述親核取代反應(yīng)溫度為80～120℃，更優(yōu)選在110℃下攪拌反應(yīng)12h；

22、進一步的，步驟(c)中使用對甲苯磺酰氯為活化劑，以三乙胺或n,n-二異丙基乙胺為縛酸劑1，活化溫度為0℃，氟化烷基醇2與活化劑、縛酸劑1的物質(zhì)的量之比為1.0：(1.5～3.0)：(2.0～4.0)，優(yōu)選為1:2:2；

23、進一步的，步驟(d)中使用碳酸鉀作為縛酸劑2，碘化鉀作為催化劑1，芐胺與活化的氟化烷基醇3、縛酸劑2、催化劑1的物質(zhì)的量之比為1.0：(2.0～4.0)：(3.0～6.0)：1.0，優(yōu)選為1.0:2.4:4.0:1.0，反應(yīng)溫度為85℃回流至反應(yīng)完全；

24、進一步的，步驟(e)中以10％鈀碳或氫氧化鈀為催化劑2，在氫氣氛圍下反應(yīng)，反應(yīng)溶劑為甲醇，芐基保護的含氟脂質(zhì)4與催化劑2中活性物質(zhì)的物質(zhì)的量之比為1.0：(0.1～0.4)。

25、進一步的，步驟(1)中所述的含氟脂質(zhì)占含氟脂質(zhì)和可電離脂質(zhì)總量的質(zhì)量比在1％～100％，優(yōu)選為50％-75％，最優(yōu)選為50％。

26、更進一步的，步驟(1)中所述的含氟脂質(zhì)、可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇脂質(zhì)的質(zhì)量比為1:(1-3)：(0.44-0.88)：(0.8-1.6)：(0.21-0.43)。

27、進一步的，步驟(2)中所述的核酸分子為質(zhì)粒dna、mrna、sirna中任意一種，所述檸檬酸溶液的ph＝3，所述水相核酸溶液中核酸的濃度小于1mg/ml。

28、進一步的，步驟(3)中所述的乙醇相脂質(zhì)溶液和水相核酸溶液的體積比為1：(0.1～10)，優(yōu)選為1:3。

29、本發(fā)明還提供了一種上述制備方法得到的含氟脂質(zhì)納米顆粒在核酸遞送載體中應(yīng)用，其可以顯著提高核酸的轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達水平。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在于：

31、本發(fā)明的制備方法得到的含氟脂質(zhì)納米顆粒通過調(diào)整含氟脂質(zhì)與可電離脂質(zhì)的比例，可以顯著提高核酸的轉(zhuǎn)染效率，這可能由于含氟脂質(zhì)納米顆粒更穩(wěn)定，具有更優(yōu)秀的細胞攝取效果以及更顯著的溶酶體逃逸效果所導致的。含氟脂質(zhì)納米顆粒組的蛋白表達水平優(yōu)于商用轉(zhuǎn)染試劑組及不含氟脂質(zhì)納米顆粒組。