本發明涉及微生物學和免疫學領域,具體涉及一種狐、貉細菌性肺炎三聯菌殼疫苗及其制備方法。
背景技術:
1、我國狐貉毛皮動物養殖場遍及河北、山東、遼寧、吉林、黑龍江等多個省份和地區,作為特色養殖業在各地受到重視和支持,維系著數百家毛皮動物養殖場的生存、發展。隨著養殖密度的增加,狐貉細菌性肺炎給養殖戶帶來的經濟損失日趨嚴重。
2、狐貉細菌性肺炎大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌均屬革蘭氏陰性菌,是自然界廣大范圍內存在的條件性致病病原體,通常通過呼吸道感染引起急性、熱性、高致死性的狐、貉細菌性呼吸道疾病。該病高發季6-9月份處于高溫高濕的季節,也是病原微生物大量繁殖期,發病率在幼獸明顯高于成年獸,常常突然發病,出現典型的呼吸道病癥狀,如打噴嚏、咳嗽、流鼻液,隨病情加重有的病例突然死亡。剖檢死亡病例可見肺臟大面積出血、肉變樣,肺臟切面有紅色泡沫狀液體流出。
3、目前對毛皮動物肺炎的治療一般選用廣譜抗菌藥,如頭孢噻肟、氨芐青霉素、恩諾沙星或碳青霉素類抗菌藥,但常因養殖戶對抗生素使用不當致使菌株耐藥性不斷增強,加上菌體自身的耐藥機制、本身攜帶的耐藥基因可以與其它病原菌發生交叉感染造成耐藥基因的傳播和傳遞等原因,對該病的防治而言是一項巨大的挑戰。
4、目前疫苗免疫接種仍是預防和控制狐貉細菌性肺炎的有效措施,但國內外針對狐貉肺炎疫苗研發主要從綠膿桿菌、大腸桿菌出發,往往忽略肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌引起的肺炎。截止到2024年根據在國家獸藥基礎數據庫官網所查詢到的信息,國內外仍缺少狐貉大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌三聯疫苗的開發研制,因此研制一種針對目前我國狐貉肺炎病原流行現狀的疫苗具有十分重要的意義。
5、中國專利《一種狐、貉肺炎三聯滅活疫苗及其制備方法》,公開號cn116098993a,。該疫苗由篩選的大腸桿菌dc176-2株,保藏編號為cgmcc?no:25233、肺炎克雷伯菌fy170-1株,保藏編號cgmcc?no:252234、奇異變形桿菌qy23-1株,保藏編號cgmcc?no:25235疫苗株滅活作為抗原組成,可同時預防由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌以及三者混合感染的狐、貉肺炎。該疫苗為三聯滅活疫苗,具有較好的免疫原性及安全性,能有效地提供同源攻毒保護及交叉保護,可達到一針多防的效果,簡化了疫苗接種的免疫程序,提高了保護效率。
6、細菌菌殼是一種缺少細胞內容物和核酸,但保留有完整細菌菌體表面抗原決定簇的非活疫苗,最常用的制備方法是利用噬菌體phix174衍生的裂解蛋白e基因的表達導致細菌兩極內外膜之間形成跨膜隧道結構,在壓強作用下通過跨膜孔道排出細菌內容物,這種e蛋白裂解作用可以應用于多種革蘭氏陰性菌,包括大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌。與傳統滅活疫苗相比,菌殼疫苗保留有完整的胞膜結構和相關抗原蛋白,具有更好的免疫效果;與弱毒疫苗相比,菌殼不含胞漿、核酸等內容物,安全性高,不具有毒力返強等風險;菌殼含有脂多糖和肽聚糖等免疫刺激復合物,因此菌殼本身就是很好的免疫佐劑,可增強對抗原的免疫應答;同時菌殼具有生產方法簡單、安全、不需要冷鏈儲存等優點。因此,菌殼疫苗在預防細菌疾病應用上前景廣泛。
7、現今使用e裂解基因的方法雖然有效,但無法完全裂解細菌,甚至可能在后期促使活菌增殖,這給疫苗的安全性帶來了潛在風險。為了解決這一難題,一般使用h2o2作為二次滅活機制。h2o2作為一種氧化劑,分解后可產生活性氧及其衍生物,活性氧能夠引發細菌細胞內分子或原子的電離,從而可以改變細菌的通透性屏障;氧化含有sh基的酶從而破壞微生物酶活性;產生化學基團作用于dna,從而破壞氨基酸和核酸。相較于傳統的滅活方法如甲醛和紫外線照射,h2o2對蛋白結構的破壞較小,能夠保留更完整的抗原表位,從而有效刺激機體免疫反應,增強ifn-γ和il-4的分泌,h2o2的這些特性在細菌學疫苗和病毒性疫苗的開發過程中已被證明具有重要價值,這一方法相比使用抗生素更為安全。
8、化學法是指在一些化合物的臨界濃度和特定時間段內制備革蘭氏陽性菌殼、革蘭氏陰性菌殼、酵母菌殼,甚至病毒菌殼的方法。氫氧化鈉(naoh)可水解蛋白質,革蘭氏陰性菌外膜上包含多種復雜的蛋白組分,通過水解膜上的蛋白可形成跨膜裂解通道,排出細胞質內容物,將細菌轉化為空細胞。
技術實現思路
1、本發明提供一種狐、貉細菌性肺炎三聯菌殼疫苗及其制備方法,目的在于制備得到的三聯菌殼疫苗其保留有細菌表面完整地抗原決定簇,具有更好的免疫保護效果,為預防引發狐貉細菌性肺炎的三種病原菌的感染提供了一種技術方案。
2、本發明采取的技術方案是:包括狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的菌殼,肺炎克雷伯菌fy170-1株的菌殼,奇異變形桿菌qy23-1株的菌殼,所述狐、貉源大腸桿菌dc176-2株、肺炎克雷伯菌fy170-1株、奇異變形桿菌qy23-1株的各菌殼濃度至少為5×107cfu/ml,比例為1:1:1。
3、本發明所述狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的菌殼,肺炎克雷伯菌fy170-1株的菌殼和奇異變形桿菌qy23-1株的菌殼分別為質粒型菌殼或化學型菌殼;
4、所述狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的保藏編號為cgmcc?no:25233,肺炎克雷伯菌fy170-1株的保藏編號cgmcc?no:25234,奇異變形桿菌qy23-1株的保藏編號cgmccno:25235;保藏日期:2022年7月4日,保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
5、本發明所述狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的質粒型菌殼的制備方法是:利用10%甘油制備得到dc176-2電轉化感受態細胞,將溫控裂解質粒pbbr1mcs-5-tlc電擊轉化進入dc176-2電轉化感受態細胞中,電轉參數為15.0kv/cm,5ms,慶大霉素gm50μg/ml抗性平板篩選得到陽性克隆重組菌株,特異性基因pcr鑒定;將鑒定正確的dc176-2重組菌株在tsa慶大霉素50μg/ml抗性平板上三區劃線,挑取單菌落于5mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中28℃過夜培養,吸取1ml過夜培養的dc176-2重組菌株菌液轉接于100mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中,28℃、175rpm振蕩培養至od600為0.45-0.55,將菌液放入42℃水浴鍋中水浴5min后立即轉移至預熱好的42℃搖床中,220rpm振蕩誘導培養10h,誘導后的菌液加入終濃度為0.1%的h2o2進行二次滅活40min,h2o2處理時的溫度為42℃,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得質粒型菌殼,4℃保存。
6、本發明所述肺炎克雷伯菌fy170-1株的質粒型菌殼的制備方法是:利用10%甘油制備得到fy170-1電轉化感受態細胞,將溫控裂解質粒pbbr1mcs-5-tlc電擊轉化進入fy170-1電轉化感受態細胞中,電轉參數為18.0kv/cm,5ms,慶大霉素gm50μg/ml抗性平板篩選得到陽性克隆重組菌株,特異性基因pcr鑒定;將鑒定正確的fy170-1重組菌株在50μg/mltsa慶大霉素抗性平板上三區劃線,挑取單菌落于5mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中28℃過夜培養,吸取1ml過夜培養的fy170-1重組菌株菌液轉接于100mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中,28℃、175rpm振蕩培養至od600為0.45-0.55,將菌液放入42℃水浴鍋中水浴5min后立即轉移至預熱好的42℃搖床中,220rpm振蕩誘導培養10h,誘導后的菌液加入終濃度為0.05%的h2o2進行二次滅活40min,h2o2處理時的溫度為42℃,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得質粒型菌殼,4℃保存。
7、本發明所述奇異變形桿菌qy23-1株的質粒型菌殼的制備方法是:利用10%甘油制備得到qy23-1電轉化感受態細胞,將溫控裂解質粒pbbr1mcs-5-tlc電擊轉化進入fy170-1電轉化感受態細胞中,電轉參數為20.0kv/cm,5ms,慶大霉素gm50μg/ml抗性平板篩選得到陽性克隆重組菌株,特異性基因pcr鑒定;將鑒定正確的qy23-1重組菌株在50μg/ml?tsa慶大霉素抗性平板上三區劃線,挑取單菌落于5mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中28℃過夜培養,吸取1ml過夜培養的qy23-1重組菌株菌液轉接于100mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中,28℃、175rpm振蕩培養至od600為0.45-0.55,將菌液放入42℃水浴鍋中水浴5min后立即轉移至預熱好的42℃搖床中,220rpm振蕩誘導培養10h,誘導后的菌液加入終濃度為0.05%的h2o2進行二次滅活40min,h2o2處理時的溫度為42℃,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得質粒型菌殼,4℃保存。
8、本發明所述狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的化學型菌殼的制備方法是:將凍存的大腸桿菌dc176-2株經復蘇、平板劃線活化后,挑取單菌落于5ml?tsb液體培養基中,37℃、175rpm振蕩培養過夜,吸取1ml過夜培養的dc176-2菌液轉接于100mltsb液體中,37℃、175rpm擴大培養16h,搖至平穩期;在dc176-2菌液中加入naoh溶液裂解,naoh處理時的溫度為37℃,終濃度為2.5mg/ml,時間為75min,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得化學型菌殼,4℃保存。
9、本發明所述肺炎克雷伯菌fy170-1株化學型菌殼的制備方法是:將凍存的肺炎克雷伯菌fy170-1株經復蘇、平板劃線活化后,挑取單菌落于5mltsb液體培養基中,37℃、175rpm振蕩培養過夜,吸取1ml過夜培養的fy170-1菌液轉接于100ml?tsb液體中,37℃、175rpm擴大培養16h,搖至平穩期;在fy170-1菌液中加入naoh溶液裂解,naoh處理時的溫度為37℃,終濃度為2.5mg/ml,時間為120min,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得化學型菌殼,4℃保存。
10、本發明所述奇異變形桿菌qy23-1株的化學型菌殼的制備方法是:將凍存的奇異變形桿菌qy23-1株經復蘇、平板劃線活化后,挑取單菌落于5mltsb液體培養基中,37℃、175rpm振蕩培養過夜,吸取1ml過夜培養的qy23-1菌液轉接于100ml?tsb液體中,37℃、175rpm擴大培養16h,搖至平穩期;qy23-1菌液中加入naoh溶液裂解,naoh處理時的溫度為37℃,終濃度為2.5mg/ml,時間為180min,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得化學型菌殼,4℃保存。
11、本發明所述三聯菌殼疫苗應用于預防由狐、貉大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌三種病原菌引發的狐、貉肺炎。
12、一種狐、貉細菌性肺炎三聯菌殼疫苗的制備方法,其特征在于,包括下列步驟:
13、(1)、制備狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的質粒型菌殼或化學型菌殼,其中:
14、1)所述狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的質粒型菌殼制備方法是:
15、利用10%甘油制備得到dc176-2電轉化感受態細胞,將溫控裂解質粒pbbr1mcs-5-tlc電擊轉化進入dc176-2電轉化感受態細胞中,電轉參數為15.0kv/cm,5ms,慶大霉素gm50μg/ml抗性平板篩選得到陽性克隆重組菌株,特異性基因pcr鑒定;將鑒定正確的dc176-2重組菌株在tsa慶大霉素50μg/ml抗性平板上三區劃線,挑取單菌落于5mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中28℃過夜培養,吸取1ml過夜培養的dc176-2重組菌株菌液轉接于100mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中,28℃、175rpm振蕩培養至od600為0.45-0.55,將菌液放入42℃水浴鍋中水浴5min后立即轉移至預熱好的42℃搖床中,220rpm振蕩誘導培養10h,誘導后的菌液加入終濃度為0.1%的h2o2進行二次滅活40min,h2o2處理時的溫度為42℃,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得質粒型菌殼,4℃保存;
16、2)所述狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的化學型菌殼制備方法是:
17、將凍存的大腸桿菌dc176-2株經復蘇、平板劃線活化后,挑取單菌落于5ml?tsb液體培養基中,37℃、175rpm振蕩培養過夜,吸取1ml過夜培養的dc176-2菌液轉接于100mltsb液體中,37℃、175rpm擴大培養16h,搖至平穩期;在dc176-2菌液中加入naoh溶液裂解,naoh處理時的溫度為37℃,終濃度為2.5mg/ml,時間為75min,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得化學型菌殼,4℃保存;
18、(2)、制備肺炎克雷伯菌fy170-1株的質粒型菌殼或化學型菌殼,其中:
19、1)所述肺炎克雷伯菌fy170-1株的質粒型菌殼制備方法是:
20、利用10%甘油制備得到fy170-1電轉化感受態細胞,將溫控裂解質粒pbbr1mcs-5-tlc電擊轉化進入fy170-1電轉化感受態細胞中,電轉參數為18.0kv/cm,5ms,慶大霉素gm50μg/ml抗性平板篩選得到陽性克隆重組菌株,特異性基因pcr鑒定;將鑒定正確的fy170-1重組菌株在50μg/ml?tsa慶大霉素抗性平板上三區劃線,挑取單菌落于5mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中28℃過夜培養,吸取1ml過夜培養的fy170-1重組菌株菌液轉接于100mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中,28℃、175rpm振蕩培養至od600為0.45-0.55,將菌液放入42℃水浴鍋中水浴5min后立即轉移至預熱好的42℃搖床中,220rpm振蕩誘導培養10h,誘導后的菌液加入終濃度為0.05%的h2o2進行二次滅活40min,h2o2處理時的溫度為42℃,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得質粒型菌殼,4℃保存;
21、2)所述肺炎克雷伯菌fy170-1株的化學型菌殼制備方法是:
22、將凍存的肺炎克雷伯菌fy170-1株經復蘇、平板劃線活化后,挑取單菌落于5mltsb液體培養基中,37℃、175rpm振蕩培養過夜,吸取1ml過夜培養的fy170-1菌液轉接于100mltsb液體中,37℃、175rpm擴大培養16h,搖至平穩期;在fy170-1菌液中加入naoh溶液裂解,naoh處理時的溫度為37℃,終濃度為2.5mg/ml,時間為120min,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得化學型菌殼,4℃保存;
23、(3)、制備奇異變形桿菌qy23-1株的質粒型菌殼或化學型菌殼,其中:
24、1)所述奇異變形桿菌qy23-1株的質粒型菌殼制備方法是:
25、利用10%甘油制備得到qy23-1電轉化感受態細胞,將溫控裂解質粒pbbr1mcs-5-tlc電擊轉化進入fy170-1電轉化感受態細胞中,電轉參數為20.0kv/cm,5ms,慶大霉素gm50μg/ml抗性平板篩選得到陽性克隆重組菌株,特異性基因pcr鑒定;將鑒定正確的qy23-1重組菌株在50μg/ml?tsa慶大霉素抗性平板上三區劃線,挑取單菌落于5mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中28℃過夜培養,吸取1ml過夜培養的qy23-1重組菌株菌液轉接于100mltsb、含gm50μg/ml液體培養基中,28℃、175rpm振蕩培養至od600為0.45-0.55,將菌液放入42℃水浴鍋中水浴5min后立即轉移至預熱好的42℃搖床中,220rpm振蕩誘導培養10h,誘導后的菌液加入終濃度為0.05%的h2o2進行二次滅活40min,h2o2處理時的溫度為42℃,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得質粒型菌殼,4℃保存;
26、2)所述奇異變形桿菌qy23-1株的化學型菌殼制備方法是:
27、將凍存的奇異變形桿菌qy23-1株經復蘇、平板劃線活化后,挑取單菌落于5mltsb液體培養基中,37℃、175rpm振蕩培養過夜,吸取1ml過夜培養的qy23-1菌液轉接于100mltsb液體中,37℃、175rpm擴大培養16h,搖至平穩期;qy23-1菌液中加入naoh溶液裂解,naoh處理時的溫度為37℃,終濃度為2.5mg/ml,時間為180min,裂解率達到100%;將裂解完全的菌液7000r/min離心30min,棄上清,1×pbs溶液洗滌3次,最后1×pbs溶液重懸沉淀菌體獲得化學型菌殼,4℃保存;
28、(4)、將上述步驟中制備的狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的質粒型菌殼,肺炎克雷伯菌fy170-1株的質粒型菌殼和奇異變形桿菌qy23-1株的質粒型菌殼按1:1:1的比例混合,各菌殼濃度至少為5×107cfu/ml;
29、或將上述步驟中制備的狐、貉源大腸桿菌dc176-2株的化學型菌殼,肺炎克雷伯菌fy170-1株的化學型菌殼和奇異變形桿菌qy23-1株的化學型菌殼按1:1:1的比例混合,各菌殼濃度至少為5×107cfu/ml。
30、本發明的有益效果在于:
31、本發明利用h2o2溶液對e基因裂解不完全的菌殼進行了二次裂解,成功解決了單獨利用e基因裂解不完全的問題。本發明利用單一的naoh溶液制備化學型菌殼疫苗,為狐貉肺炎大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌菌殼疫苗的制備提供了新思路,并且操作簡單、成本低廉、無明顯副作用。本發明制備的狐貉肺炎大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌三聯質粒型菌殼疫苗和三聯化學型菌殼疫苗可以刺激機體產生高于傳統甲醛滅活疫苗的igg抗體水平,可同時預防由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌以及三菌混合感染的狐、貉肺炎。本發明為進一步研究狐貉肺炎大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌三聯菌殼疫苗奠定了基礎。