本發明屬于藥物,具體涉及一種促進成年哺乳動物視網膜müller膠質細胞增殖及轉分化為視網膜前體細胞的小分子組合物。
背景技術:
1、視網膜疾病影響感光細胞和神經節細胞活性和功能,導致視網膜盲,依然缺乏有效的治療方法。在視網膜損傷、感染或疾病條件下,感光細胞/神經節細胞死亡,由于神經元細胞無法增殖替代受損的細胞,干細胞療法成為治療視網膜致盲疾病的新方向。
2、目前干細胞治療視網膜疾病主要有兩個方向:1、采用胚胎干細胞/ipsc體外分化產生神經元并進行移植;2、啟動內源性干細胞經過類似發育的過程分化為成熟的神經元。由于外源移植神經元面臨免疫排斥、神經元環路整合等難題,因此啟動內源性干細胞日益成為研究的重點。
3、müller膠質細胞(穆勒細胞,繆勒氏細胞)是視網膜內最主要的大膠質細胞,也是最有潛力成為內源性干細胞的視網膜細胞。但是,與低等冷血動物斑馬魚和蟾蜍不同,哺乳動物視網膜中的müller膠質細胞盡管在視網膜損傷后激活,短暫表達前體細胞的標志物pax6,但是快速啟動高表達纖維化相關基因,導致視網膜膠質瘢痕的形成,影響視覺功能。當前的研究數據表明,如果哺乳動物的müller膠質細胞可以進入正常的細胞周期,完成細胞增殖,就可以實現向前體細胞的轉化,并有希望繼續分化產生功能性的神經元。但是müller膠質細胞僅短暫表達細胞周期的相關基因cyclind等,并無法真正進入細胞周期。目前,促進哺乳動物的müller膠質細胞進入正常的細胞周期、促進其增殖、向前體細胞轉化的報道主要有:
4、(1)在müller膠質細胞中敲除細胞周期抑制基因p53,在體外顯示müller膠質細胞向視網膜前體細胞的轉化,前體細胞標志物nestin、pax6和chx10的表達升高。(參考文獻:doi:10.1002/glia.22377,doi:10.1074/jbc.m113.532671)。但p53是重要的抑癌基因,p53缺失會導致腫瘤發生的風險升高。
5、(2)通過添加神經營養因子egf/fgf1+insulin促進müller膠質細胞增殖。(參考文獻:doi:10.1002/glia.22472,doi:10.1073/pnas.0807453105)。但這種方法,細胞增殖的比例相對較低。
6、(3)采用轉基因的方法使用腺相關病毒載體及müller膠質細胞特異性啟動子在müller膠質細胞中過表達wnt通路下游重要轉錄因子β-catenin促進細胞增殖。(參考文獻:doi:10.1038/s41586-018-0425-3)。但采用轉基因的方法過表達癌基因,可能導致細胞的過度增殖和腫瘤發生。
7、(4)采用轉基因方法在müller膠質細胞中過表達持續激活形式的yap變異體yap5sa,促進müller膠質細胞增殖,并表達視網膜前體細胞標志物(參考文獻:doi:10.1016/j.celrep.2019.04.045,doi:10.1016/j.celrep.2019.04.047)。但yap是重要的癌基因,這種方法可能導致腫瘤的發生。同時,由于müller膠質細胞無法退出細胞周期,無法實現后續的神經元分化。
8、(5)采用lats1/2的小分子抑制劑促進müller膠質細胞增殖(doi:10.1038/s41467-021-23395-3)。但這種方法,細胞增殖的比例相對較低。
9、因此,還有必要繼續研究促進哺乳動物的müller膠質細胞進入正常的細胞周期、促進其增殖、向前體細胞轉化乃至分化的方法。
技術實現思路
1、本發明的目的在于克服現有技術的不足之處,提供了小分子藥物組合物及其應用。本發明主要采用小分子的藥物組合物幫助成年哺乳動物müller膠質細胞進入細胞周期,完成細胞增殖,從而實現:1、幫助müller膠質細胞轉分化為神經前體細胞;2、在müller膠質細胞轉分化為神經元后補充müller膠質細胞,維持視網膜的正常結構。
2、本發明解決其技術問題所采用的技術方案之一是:
3、一種小分子藥物組合物,所述小分子藥物組合物包括hippo信號通路的抑制劑和wnt信號通路的激活劑。
4、進一步地,所述hippo信號通路的抑制劑包括mst1/2的抑制劑、map4ks的抑制劑或lats1/2激酶的抑制劑中的至少一種。
5、優選地,所述lats1/2激酶的抑制劑包括lats-in-1,如下式所示。
6、
7、進一步優選地,所述lats-in-1的劑量為不低于8μm。
8、優選地,所述wnt信號通路的激活劑包括chir-99021,如下式所示。
9、
10、進一步優選地,所述chir-99021的劑量為不低于3μm。
11、更優選地,所述小分子藥物組合物為lats1/2激酶的抑制劑lats-in-1和wnt信號通路的激活劑chir-99021。所述lats-in-1的劑量例如為8~12μm。所述chir-99021的劑量例如為3~5μm。
12、本發明解決其技術問題所采用的技術方案之二是:
13、所述小分子藥物組合物在制備哺乳動物視網膜müller膠質細胞的細胞周期調節劑中的應用,所述應用為促進所述müller膠質細胞進入細胞周期。
14、本發明解決其技術問題所采用的技術方案之三是:
15、所述小分子藥物組合物在制備哺乳動物視網膜müller膠質細胞的細胞增殖促進劑中的應用。
16、本發明解決其技術問題所采用的技術方案之四是:
17、所述小分子藥物組合物在制備促進哺乳動物視網膜müller膠質細胞向前體細胞轉化的轉化促進劑中的應用。
18、本發明解決其技術問題所采用的技術方案之五是:
19、所述小分子藥物組合物在制備促進哺乳動物視網膜müller膠質細胞向神經元分化的分化促進劑中的應用。
20、本發明解決其技術問題所采用的技術方案之六是:
21、一種利用所述小分子藥物組合物促進哺乳動物視網膜穆勒細胞增殖的方法,其特征在于:在培養基中添加不低于8μm?lats-in-1和不低于3μm?chir-99021與視網膜外植體共培養。
22、本發明所涉及的設備、試劑、工藝、參數等,除有特別說明外,均為常規設備、試劑、工藝、參數等,不再作實施例。
23、本發明所列舉的所有范圍包括該范圍內的所有點值。
24、本發明所述“大約”、“約”或“左右”等指的是所述范圍或數值的±20%范圍內。
25、本技術方案與背景技術相比,它具有如下優點:
26、本發明通過使用lats-in-1抑制hippo信號通路的關鍵激酶lats1/2激活yap,聯合具有口服活性的gsk-3α/β抑制劑chir-99021激活wnt信號通路的小分子藥物組合促進視網膜müller膠質細胞增殖,實現向前體細胞的轉分化。與現有技術相比:
27、(1)在müller膠質細胞中敲除細胞周期抑制基因p53,在體外顯示müller膠質細胞向視網膜前體細胞的轉化,前體細胞標志物nestin、pax6和chx10的表達升高。(參考文獻:doi:10.1002/glia.22377,doi:10.1074/jbc.m113.532671)。相比而言,本發明的優勢:不涉及轉基因操作,安全性更好。
28、(2)通過添加神經營養因子egf/fgf1+insulin促進müller膠質細胞增殖。(參考文獻:doi:10.1002/glia.22472,doi:10.1073/pnas.0807453105)。相比而言,本發明的優勢:大幅度提高müller膠質細胞的增殖。
29、(3)采用轉基因的方法使用腺相關病毒載體及müller膠質細胞特異性啟動子在müller細胞中過表達wnt通路下游重要轉錄因子β-catenin促進細胞增殖。(參考文獻:doi:10.1038/s41586-018-0425-3)。相比而言,本發明的優勢:不涉及轉基因操作,安全性更好。
30、(4)采用轉基因方法在müller膠質細胞中過表達持續激活形式的yap變異體yap5sa,促進müller膠質細胞增殖,并表達視網膜前體細胞標志物(參考文獻:doi:10.1016/j.celrep.2019.04.045,doi:10.1016/j.celrep.2019.04.047)。相比而言,本發明的優勢:不涉及轉基因操作,安全性更好。可以在停藥后允許成為前體細胞的müller膠質細胞退出細胞周期,并分化形成功能性神經元。
31、(5)采用lats1/2的小分子抑制劑促進müller膠質細胞增殖(doi:10.1038/s41467-021-23395-3)。相比而言,本發明的優勢:大幅度提高müller膠質細胞的增殖。