一種用于治療宮頸癌的中藥提取物的組合物的制作方法

本發明屬于醫藥
技術領域：
，所述中藥提取物組合物由連翹和甘草兩味中藥組成。具體涉及一種由連翹乙醇提取物與甘草丙酮提取物組成的天然中藥提取物組合物，該中藥提取物的組合物用于制備治療宮頸癌藥物開發中的用途。
背景技術：
：惡性腫瘤是人類因疾病致死的第一因素。而子宮頸癌更是婦科常見的惡性腫瘤之一，發病率低于乳腺癌，死亡率低于居首位的卵巢癌，位居婦科惡性腫瘤第二位，嚴重影響和侵害女性的身心健康。根據古籍、古方中的記載，從中草藥植物中提取有效組分，應用于當前疾病的臨床治療已取得突破性的進展。其中包括從中藥中提取有效的抗腫瘤成分治療相關腫瘤疾病，受到越來越多的研究人員重視，并得到了病患的接受，已經成為目前治療惡性腫瘤的有效方法。傳統中草藥及天然產物中有效抗腫瘤成分的治療也屬于一種治療手段。目前，從中藥中獲取抗腫瘤有效成分已成為腫瘤防治的研究熱點。有文獻報道已經證實甘草具有抗腫瘤功效，能激活多種癌細胞發生凋亡（夏嵐，中華疾病控制雜志，201014（6）:524-527）。連翹提取物具有廣譜抗腫瘤活性，對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用（抗腫瘤中藥的臨床應用主編張民慶，人民衛生出版社，63）。但是該兩種藥物在抗腫瘤作用方面，藥物使用劑量大，抗癌效果有限，同時長期服用連翹還會造成肝腎功能的損害。并且過量的使用甘草還會導致血壓升高，肌肉無力，慢性疲勞，頭痛，腫脹，男性睪酮水平降低而引起陽痿、睪丸和陰莖萎縮等問題。因而需要探尋研發一種治療效果穩定、高效低毒副作用的增效作用顯著的天然藥物組合物。連翹是我國傳統中草藥之一（始載于《神農本草經》），藥用部分主要是果實；并且在傳統醫學中，甘草多屬于使藥，它有調和諸藥的功能，而且很多傳統藥方都用上甘草配搭（《傷寒論》、《金匱要略》）。本發明人經過前期的實驗和研究，得到了本發明的連翹乙醇提取物與甘草丙酮提取物組成的天然中藥提取物的組合物，并且反復試驗找到最佳地藥物配比組合，并證明了其對宮頸癌細胞具有極好的抗腫瘤功效，兩味中藥的配伍起到了增效作用并減少了藥物的使用劑量，降低了毒副作用，最終完成了本發明。技術實現要素：本發明的目的是為了解決抗腫瘤藥物中現有技術所存在的不足，克服傳統化療藥物會導致骨髓功能受到抑制、免疫功能降低和抗藥性等問題；以及單味中草藥使用劑量大，毒副作用難以控制，抗癌效果局限的不足。研發一種高效低毒、多靶點、多效應、不易產生耐藥性、價格低廉、藥源豐富，易于推廣的抗腫瘤藥物，本發明提出一種用于治療宮頸癌的中藥提取物的組合物。具體而言，本發明提供了一種中藥提取物的組合物，由連翹乙醇提取物與甘草丙酮提取物以重量計按1-4:1的比例組成，均發現在這種用量范圍內的中藥提取物的組合物能獲得很好的協同作用。上述中藥提取物的組合物，其中連翹乙醇提取物與甘草丙酮提取物的用量配伍比例是2:1，其抑制宮頸癌細胞增值，誘導宮頸癌細胞凋亡效果最佳。其中，連翹乙醇提取物與甘草丙酮提取物本領域技術人員公知的常規方法進行提純獲得，采用常規方法獲得的這些成分或商業購得的成分組成的本發明的天然中藥提取物的組合物均能獲得相同的療效。優選地，上述中藥提取物的組合物中連翹乙醇提取物的制備方法是:取連翹干燥果實，水洗除塵，蒸餾水浸泡過夜，文火煮沸2h，紗布過濾收集濾液，沉淀物重復上述操作；水提液100℃蒸發濃縮定容至1mg/ml后，90%乙醇溶液震蕩混勻，室溫浸提8h，低溫離心10min（4℃，5000r/min），收集上清液，加壓濃縮后，浸膏冷凍干燥，即得。上述中藥提取物的組合物中甘草丙酮提取物的制備方法是:將甘草根清洗，干燥，粉碎，過篩，水浸，低溫離心10min（4℃，5000r/min），取沉淀物，以1g:10ml比例與丙酮混合，浸提8h，低溫離心10min（4℃，5000r/min），收集上清液，旋轉蒸發，浸膏冷凍干燥，即得。本發明的中藥提取物的組合物的制備方法是：按前述比例選取連翹乙醇提取物和甘草丙酮提取物，定比定量均勻溶解于乙醇溶液中，即得。本發明的天然中藥提取物組合物在抑制宮頸癌細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡方面與現有單味中草藥相比具有以下幾點有益效果。本發明天然中藥提取物組合物，在應用mtt比色法檢測不同藥物對宮頸癌hela細胞增殖的抑制作用實驗結果顯示:本發明天然中藥提取物組合物隨藥物濃度的增加，其對hela細胞增殖抑制作用增強，呈現出很好的劑量效應關系，并且其抑制率與其他單味中藥對照組均有顯著性差異。表明本發明天然中藥提取物組合物對hela細胞增殖抑制作用優于其單味中藥成分。在采用流式細胞儀雙染法檢測hela細胞凋亡率的實驗結果，證明了本天然中藥提取物組合物作用于hela細胞后能夠體外誘導細胞凋亡，殺死腫瘤細胞。并經統計分析對比得出，其誘導細胞凋亡率高于單味中藥對照組，差異具有統計學意義。本發明人創造性地將連翹乙醇提取物與甘草丙酮提取物進行配伍組合，實驗確定組份的配比用量范圍，確定最佳配伍比例2:1，能夠使該組合物發揮了最大的協同增效作用，而且極大降低了該兩味中藥的單獨使用劑量，這是本發明人創造性實驗過程的結果，本領域普通技術人員僅僅通過公開的內容無法簡單獲得這種配伍組合及配比用量范圍。該天然中藥提取物組合物連翹乙醇提取物與甘草丙酮提取物均可通過常規提取手段獲得，天然中藥提取物組合物的原材料充足，提取過程簡單易操作。使得該天然中藥提取物組合物具有成本低廉、獲得方便、易于投入生產的效果。圖1是中藥提取物的組合物的制備及應用流程圖。圖2是不同藥物對hela細胞增殖抑制的作用濃度—抑制率關系曲線圖。圖3是不同藥物對hela細胞誘導凋亡的作用濃度—凋亡率關系曲線圖。具體實施方式實施例1：中藥提取物組合物的藥物毒性試驗觀察測定。實驗材料：（1）實驗細胞：人宮頸癌hela細胞株：購自中國科學院上海細胞庫，常規方法傳代培養；（2）實驗藥物：中藥連翹干燥果實，產地山西；中藥甘草根，產地內蒙古，均購自黑龍江省中醫藥學會國醫堂門診部，經黑龍江省食品藥品檢驗檢測所中藥室鑒定合格。實驗方法：（1）中藥連翹乙醇提取物的提取按照常規方法進行提純獲得：具體步驟為取連翹干燥果實，水洗除塵，蒸餾水浸泡過夜，文火煮沸2h，紗布過濾收集濾液，沉淀物重復上述操作；水提液100℃蒸發濃縮定容至1mg/ml后，90%乙醇溶液震蕩混勻，室溫浸提8h，低溫離心10min（4℃，5000r/min），收集上清液，加壓濃縮后，浸膏冷凍干燥，即得；（2）中藥甘草根丙酮提取物的提純方法同樣按照常規方法獲得，具體為首先使用蒸餾水對甘草根清洗2遍，置通風干燥環境自然晾干，而后經中藥超微粒粉碎機粉碎成粉。再將甘草粉以1g:20ml比例溶解于蒸餾水中，浸泡過夜，低溫離心10min（4℃，5000r/min），收集沉淀物；干燥后，再以1g:10ml比例與丙酮溶液混合，浸泡過夜，低溫離心10min（4℃，5000r/min），收集上清液；經旋轉蒸發器濃縮，鼓風干燥烘干。再經甲醇的溶解，低溫離心10min（4℃，5000r/min），得到該提取物。將上述兩種藥物的提取物按重量份以2:1的配伍比例進行均勻混合，即得中藥提取物組合物；（3）中藥提取物組合物對hela細胞的藥物毒性測定：將兩種中藥提取物（連翹乙醇提取物和甘草丙酮提取物）按不同配伍比例（1:1、2:1、3:1、4:1、5:1）及不同倍比稀釋濃度劑量120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml、3.75μg/ml；另設溶媒陰性對照組(乙醇濃度0.5%)加入到hela細胞96孔培養板中。置35℃、5%co2培養箱內培養，倒置顯微鏡下觀察12h、24h、48h細胞的生長情況。采用cpe法進行記錄，見表1。表1：藥物毒性指標：細胞病變作用（cpe）。細胞病變作用（cpe）細胞狀態“0”：無cpe細胞形態正常、貼壁生長良好“1”：cpe為1%－25%細胞圓縮或細胞破碎“2”：cpe為26%－50%細胞圓縮或細胞破碎“3”：cpe為51%－75%細胞圓縮或細胞破碎“4”：cpe為76%－100%細胞圓縮或細胞破碎實驗結果：記錄每孔細胞cpe的程度：“0”：無cpe；“1”：cpe為1%～25%；“2”：cpe為25%～50%；“3”：cpe為50%～75%；“4”：cpe為75%～100%，結果見表2。表2中藥提取物組合物不同配伍比例不同濃度劑量作用hela細胞12h、24h、48h的毒性檢測。實施例2：mtt比色法檢測中藥提取物組合物對hela細胞增殖抑制率及細胞毒性（ic50）測定。1、實驗材料：同實施例1。2、實驗方法：取處于對數生長期狀態良好的hela細胞消化成細胞懸液，并用細胞培養液調整細胞密度，使之達到1.0×105個/ml。將細胞懸液按照100μl/孔加入96孔板，co2培養箱中溫孵24h。藥物配比2:1，藥物終濃度依次為120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml、3.75μg/ml，每孔100μl。并設立連翹乙醇提取物組，甘草丙酮提取物組，順鉑（ddp）藥物對照組，溶媒陰性對照組（酒精濃度低于0.5%時不影響細胞生長）以及空白對照組（只加培養液，不加細胞和藥物）。co2培養箱中分別溫孵培養12h、24h和48h。棄去培養液，pbs清洗，加入0.5mg/ml的mtt，每孔200μl，co2培養箱中繼續孵育4h。觀察到藍紫色沉淀形成后，吸棄mtt溶液，加入200μldmso，振蕩10min。用酶標儀在490nm波長處測定吸光值。計算藥物對腫瘤細胞的抑制率：腫瘤細胞生長抑制率=[（實驗組od-對照組od）－（對照組od值－空白組od值）/（對照組od值－空白組od值）]×100%，計算出ic50并繪制劑量-反應曲線。實驗結果：根據實驗結果，本發明中藥提取物組合物隨藥物濃度的增加，其對hela細胞增殖抑制作用增強，呈現出很好的劑量效應關系，并且其抑制率與其他單味中藥對照組均有顯著性差異（p＜0.05）。計算得出，中藥提取物組合物的半數抑制濃度（ic50）為10.90μg/ml，結果見表3。表3不同濃度藥物作用24h對hela細胞增殖的抑制率。實施例3：應用流式細胞儀annexinv-pi雙染法檢測中藥提取物組合物誘導人宮頸癌hela細胞凋亡情況。實驗材料：同實施例1。實驗方法：取處于對數生長期狀態良好的hela細胞接種于50ml培養瓶中，置于37℃、5%co2培養箱溫孵，調整細胞數量1×106個/ml。將中藥提取物組合物（2:1）終濃度分別稀釋至120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml、3.75μg/ml于50ml培養瓶中，并設立連翹乙醇提取物對照組，甘草丙酮提取物對照組，溶媒陰性對照組。37℃、5%co2培養箱中溫孵培養24h。4℃、1000r/min條件下離心10min，棄上清后收集細胞，重復前述條件用pbs清洗兩次。用200μl結合緩沖液重懸細胞，而后加入10μlannexinⅴ-fitc和5μlpi輕搖混勻，避光室溫反應15min或4℃反應30min。加入300μl結合緩沖液，并在1h內上流式細胞儀檢測。實驗結果：分析結果顯示溶媒對照組細胞凋亡率為(3.52±1.94)%，中藥提取物組合組（2:1）與其他單味藥物對照組比較，各組間差異均有顯著性（p＜0.01），且隨劑量的升高凋亡率也增加，呈現明顯的濃度依賴性（p＜0.05），結果見表4。表4不同濃度中藥提取物組合物（2:1）誘導hela細胞凋亡率的情況。當前第1頁12