納米珍珠粉/C?HA復合支架的制備方法與流程

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種納米珍珠粉/c-ha復合支架的制備方法。
背景技術：
：骨缺損已成為全球健康問題。隨著人口老齡化和社會的發展，骨缺損的修復已成為一個重要的臨床課題和社會需求。目前，臨床上對于骨缺損的治療主要依賴于同種異體骨移植或自體骨移植，但這兩種治療方式都存在很多的限制。長期以來，自體骨移植都被公認為骨移植的金標準，但存在可取骨量有限、供區并發癥、移植的骨塊易吸收等缺點；異體骨移植則存在免疫排斥反應和傳播傳染性疾病的風險。隨著醫學、生物學和材料科學的發展，金屬材料、無機非金屬材料和有機材料也被應用于骨缺損的修復。然而，研究較多的不銹鋼、鈦合金、氧化鋁陶瓷等都屬于生物惰性材料，不能很好地與組織結合，限制了其臨床應用。因此，臨床對具有促進骨組織再生，且具有良好力學性能和生物相容性的合成材料的需求持續增長。目前，骨組織工程已成為骨再生治療的一種有效方法。與傳統方法不同，骨組織工程旨在規避現有臨床治療方法的局限性，對受損的組織或器官制備個體化的生物替代品。骨組織工程通常是指利用多孔生物可吸收支架，引導組織細胞的粘附、增殖和分化，從而促進組織再生。支架可模擬天然骨的功能，是骨組織工程中最重要的部分。理想的支架應具備以下特征：①具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性；②具有合適的孔隙結構，有利于細胞的增殖、血管的生長和營養物質的運輸；③具有良好的表面形態和理化性質，能夠誘導細胞內信號的釋放；④能適應骨缺損的特定形狀。骨組織支架應具有適當的機械性能，適應人類骨骼系統復雜的應力環境，與新生骨組織結合。如果支架的彈性模量過大，植入一段時間后會導致應力遮擋，最終會導致骨修復的失敗。支架的加工條件和應用環境在很大程度上取決于支架材料的物理性能和機械性能。生物活性陶瓷可以促進成骨細胞的生長和分化，然而，由于其脆性大，難以成型，降解非常緩慢等缺點，其臨床應用受到限制。此外，生物活性陶瓷的精確性較差，且多孔陶瓷支架上形成的新骨也不能維持負重骨所需的機械負荷。因此，其臨床應用也受到較多限制。支架除了需要適當的機械性能，還需要獲得多孔結構，為細胞的粘附和增殖提供空間，這也是支架的關鍵點。天然骨具有多層次的三維孔隙結構，孔隙直徑從幾納米到幾百微米不等，可滿足組織生長的不同要求。通常情況下，直徑150-800μm的孔徑可允許骨組織和大血管的長入；直徑10-100μm的孔隙有利于毛細血管的生長，營養物質的交換和代謝廢物的排出；納米級的孔隙能夠提供更大的比表面積，有利于磷灰石的形成和成骨細胞蛋白質的粘附，對成骨細胞的粘附和增殖具有重要意義。近年來，研究者們已找到一些制備具有可控孔隙結構和形狀的支架的方法，如熔融沉積建模，立體光刻和3d打印技術。guo等通過模板化的fdm法制備了具有良好機械性能和拓撲性質的支架，他們發現，隨著基體模量的增加，支架的孔徑減小，并能促進骨髓干細胞的成骨分化。利用間接sl技術制備了磷酸鈣骨水泥支架材料，支架的內部具有高度開放、互相連接的通道結構。利用3d打印技術將羥基磷灰石和聚(乙烯)乙醇制備成骨組織支架，支架的結構可以預先設計，并確保大部分的互聯性。然而，由于光斑或噴嘴直徑的局限性，這些技術很難制備孔徑范圍從幾納米到幾微米的支架。因此，它不能滿足不同組織生長的需求。冷凍干燥法又稱升華干燥法，其原理是首先將含水的物料冷凍到冰點以下，使液態的水凝固成固態，然后在較高真空條件下，將冰直接升華為蒸氣而除去。水分升華后留下的孔隙就構成支架的孔隙結構，因此，冷凍干燥法可通過控制溶液濃度的大小來控制孔隙率。干燥過程均在較低溫度下進行，避免了對支架材料中蛋白的不良影響。由于這些優點，越來越多地學者選擇冷凍干燥法來進行骨組織支架的制備。有人采用冷凍干燥法制備了多孔羥基磷灰石/殼聚糖-海藻酸鈉復合支架，具有高度多孔性，孔隙之間相互關聯。通過mtt試驗發現，所制備的羥基磷灰石/殼聚糖-海藻酸鈉復合支架未對mg-63細胞產生毒性，表明復合支架具有良好的細胞相容性。進一步將羥基磷灰石/殼聚糖-海藻酸鈉復合支架植入小鼠的顱骨，發現復合支架可促進體內骨缺損的修復。也有人采用冷凍干燥法將珍珠粉與聚乳酸復合，成功制備了具有良好生物相容性的plla/文石型珍珠粉支架和plla/貝殼珍珠層粉支架，并發現這兩種支架能夠促進小鼠骨髓間充質干細胞的增殖和分化。還有人采用冷凍干燥法將貝殼粉加入到藻酸鹽中，制備成三維多孔支架，發現能促進細胞的粘附和增殖，在骨組織工程有良好的應用前景。羥基磷灰石、β-磷酸三鈣等磷酸鹽生物陶瓷應用于骨組織工程，已有30多年的歷史。但是，羥基磷灰石在體內不易降解，磷酸三鈣的降解速度又無法調控，而天然生物材料具有良好的生物相容性及生物可降解性，并能通過誘導生物信號因子的釋放，促進成骨細胞的粘附、增殖和分化。并且，隨著組織工程技術的發展，將天然生物材料進行改性，可進一步增強其促進骨再生的能力，為骨缺損的修復帶來了福音。長期以來，珍珠粉在中國被廣泛應用于中藥、化妝品和保健品等多個領域。珍珠粉有很高的藥用價值，由文石型碳酸鈣晶體和嵌入其中的有機基質組成，并含有多種能夠促進骨形成的信號分子，具有良好生物相容性，是一種很有應用前景的骨修復材料。珍珠粉含有豐富的礦物質，尤其是含有高質量的鈣和“信號蛋白”，能通過分泌信號因子控制細胞的生長和修復。珍珠粉所含有的信號蛋白，能促進皮膚再生和組織修復。研究表明，珍珠粉的水溶性基質和分子量大于14kda的不溶物都能夠顯著地促進成纖維細胞的增殖、膠原沉積和timp-1的生成，從而促進傷口愈合，且其主要活性成分可能是質量大于14kda的不溶物。此外，這些信號蛋白在促進骨骼健康方面也有重要作用；它們可以促進骨細胞的分化，加速其礦化，從而增加現有骨的密度。因此，如果可將珍珠粉應用在骨組織支架上，那么將會在三維細胞培養、組織工程支架和再生醫學領域具有廣泛的應用前景。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是提供一種具有合適的孔隙結構，有利于細胞的增殖、血管的生長和營養物質的運輸，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，能適應骨缺損的特定形狀的納米珍珠粉/c-ha復合支架制備方法。為了解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：納米珍珠粉c-ha復合支架的制備方法，其操作方法為：一、將殼聚糖和透明質酸分別溶解到濃度為1％的醋酸溶液，以2000rpm的速度攪拌5min，室溫條件下放置24h，得殼聚糖醋酸溶液和透明質酸醋酸溶液；二、24h后將殼聚糖醋酸溶液和透明質酸醋酸溶液混合，以2000rpm的速度攪拌5min；三、加入1～25％的納米珍珠粉，以2000rpm的速度攪拌5min；四、-20℃冰箱24h，再冷凍干燥24h，得復合支架。采用本發明技術方案制備的納米珍珠粉/c-ha復合支架，據試驗研究，本發明的復合支架良好的潤濕性、抗壓強度，且有利于細胞的增殖，且具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，能適應骨缺損的特定形狀的納米珍珠粉/c-ha復合支架及其應用。進一步，所述的透明質酸、殼聚糖的比例為：透明質酸1％、殼聚糖4％。進一步，所述的原料中所含珍珠粉的比例為1～20％。進一步，所述的原料中所含珍珠粉的比例為5～20％。進一步，制備而成的復合支架，其形狀為直徑為10～20mm，高度為2～10mm的圓柱體，具有多個均勻分布的孔隙結構。進一步，制備而成的復合支架，其孔隙結構的孔隙率為89～93％之間。進一步，制備而成的復合支架，其晶型包括文石型碳酸鈣晶型和方解石晶型。進一步，所述的制成的復合支架的直徑為15mm，高度為5mm。通過本發明納米珍珠粉c-ha復合支架的制備方法制備而成的復合支架，通過試驗研討了其復合支架的各項性能及其成骨機制，結論為：(1)隨著納米珍珠粉比例的增加，復合支架的潤濕性和抗壓強度增加，但是支架的孔隙結構受到干擾，孔隙率輕度下降。復合過程中，納米珍珠粉的晶型未發生改變。(2)小鼠mc3t3-e1細胞在復合支架上生長良好，呈梭形，分布較均勻。納米珍珠粉的增加促進了mc3t3-e1細胞的增殖和分化，對細胞的凋亡無明顯影響，復合支架的細胞相容性良好。(3)rt-qpcr試驗發現，納米珍珠粉含量為10％和25％的支架組colαi、ocn、opn和runx2四個基因的表達高于對照組。westernblotting試驗中，納米珍珠粉含量為10％和25％的支架組colαi、ocn、opn和runx2四個蛋白的合成高于對照組；但納米珍珠粉含量為0％的支架組部分蛋白的合成低于對照組。高比例的納米珍珠粉/c-ha復合支架可能通過上調i型膠原蛋白、骨鈣素、骨橋素和runx2基因的表達和蛋白的合成促進成骨。由此可見，納米珍珠粉/c-ha復合支架在骨組織工程方面有良好的應用前景。附圖說明圖1是本發明實驗一的各組復合支架的大致形態圖；圖2是本發明實驗一的在掃描電鏡下納米珍珠粉濃度為0％的復合支架的孔隙形態圖；圖3是本發明實驗一的在掃描電鏡下納米珍珠粉濃度為1％的復合支架的孔隙形態圖；圖4是本發明實驗一的在掃描電鏡下納米珍珠粉濃度為2.5％的復合支架的孔隙形態圖；圖5是本發明實驗一的在掃描電鏡下納米珍珠粉濃度為5％的復合支架的孔隙形態圖；圖6是本發明實驗一的在掃描電鏡下納米珍珠粉濃度為10％的復合支架的孔隙形態圖；圖7是本發明實驗一的在掃描電鏡下納米珍珠粉濃度為25％的復合支架的孔隙形態圖；圖8是本發明實驗五的各組復合支架的xrd譜圖；圖9是本發明實驗六中納米珍珠粉的傅里葉變換紅外光譜圖；圖10是本發明實驗六中殼聚糖的傅里葉變換紅外光譜圖；圖11是本發明實驗六中透明質酸的傅里葉變換紅外光譜圖；圖12是本發明實驗六中納米珍珠粉濃度為0％的復合支架的傅里葉變換紅外光譜圖；圖13是本發明實驗六中納米珍珠粉濃度為1％的復合支架的傅里葉變換紅外光譜圖；圖14是本發明實驗六中納米珍珠粉濃度為2.5％的復合支架的傅里葉變換紅外光譜圖；圖15是本發明實驗六中納米珍珠粉濃度為5％的復合支架的傅里葉變換紅外光譜圖；圖16是本發明實驗六中納米珍珠粉濃度為10％的復合支架的傅里葉變換紅外光譜圖；圖17是本發明實驗六中納米珍珠粉濃度為25％的復合支架的傅里葉變換紅外光譜圖；圖18是本發明實驗六中納米珍珠粉、殼聚糖、透明質酸、納米珍珠粉的比例為0％～25％的復合支架的傅里葉變換紅外光譜比較圖；圖19是本發明實驗七中的掃描電鏡下mc3t3-e1細胞的形態圖；圖20是本發明實驗七中mc3t3-e1細胞在復合支架上的分布圖。具體實施方式一、實施例：本發明納米珍珠粉/c-ha復合支架，其中原料中含有珍珠粉的比例如表1所示，單位wt％：表1實施例原料中所含納米珍珠粉的比例wt％實施例一1實施例二2.5實施例三5實施例四10實施例五25現以實施例三為例，具體說明本發明納米珍珠粉/c-ha復合支架的制備方法；實施例三：1、試劑，如表2所示表2試劑公司和型號微米珍珠粉海南京潤珍珠生物技術股份有限公司透明質酸鈉h107141，aladdin殼聚糖c105803，aladdin醋酸分析純，aladdin2、儀器如表3所示表33、操作步驟1)通過納米陶瓷砂磨分散機采用機械球磨法將微米珍珠粉研磨成納米珍珠粉，干燥消毒；2)將4wt％殼聚糖和1wt％透明質酸分別溶解到1％的醋酸溶液中，在thinky攪拌機中以2000rpm的速度攪拌5min，室溫條件下放置24h，得殼聚糖醋酸溶液和透明質酸醋酸溶液；3)24h后將殼聚糖醋酸溶液和透明質酸醋酸溶液混合，在thinky攪拌機中以2000rpm的速度攪拌5min；4)然后加入2.5wt％的納米珍珠粉，以2000rpm的速度攪拌5min；5)用注射器將溶液澆鑄在24孔板中，每孔0.5ml，在-20℃冰箱24h，冷凍干燥24h，得納米珍珠粉/c-ha復合支架。二：納米珍珠粉/c-ha復合支架的性能確認1、實驗組：實驗組一：與實施例三相比，區別僅在于原料中所含納米珍珠粉的比例為0wt％；實施例一～實施例五2、實驗試劑與儀器與實施例的試劑與儀器相同一)、實驗一：對復合支架表面形貌的確定1、通過掃描電子顯微鏡觀察復合支架的表面形貌將樣本切成3mm寬的薄片，使樣品表面盡量平整。用真空冷凍干燥機干燥后將樣品依次粘在導電膠上，在導電膠的左上角做好標記，將樣本表面噴金60s。然后打開掃描電子顯微鏡(mira3，捷克)的樣品室，將所要觀察的樣品固定，抽真空，用掃描電鏡直接觀察斷面形貌。2、結論如圖1所示，支架具有高度多孔性，孔隙均勻分布，連通良好。進一步觀察發現，當納米珍珠粉含量較低時，復合支架的孔隙結構與實驗組一：單純的殼聚糖-透明質酸支架相似。然而，如圖2～圖7所示，隨著納米珍珠粉含量從0％逐漸提高，當達到25％，支架的表面逐漸粗糙，孔隙結構趨于紊亂，局部發生斷裂。說明原料中所含納米珍珠粉的比例為1～25wt％，其形貌均可滿足復合支架的外形要求。二)、實驗二：對復合支架孔隙率的確定1、方法復合支架的孔隙率(％)、總入量(ml/g)和總孔面積(m2/g)通過高性能全自動壓汞儀測得。將通過實施例一～實施例五、實驗組一制備的復合支架樣品放置在樣品盒內，調節壓力，使水銀進入材料中所有的孔，測定樣品浸潤前后的重量。2、結論如表4所示：隨著納米珍珠粉比例的增加，支架的孔隙率和總入量減少，而總孔面積增加，但實驗組一和實施例一～實施例五都具有較高的孔隙率，為89％至93％之間，實施例一的孔隙率低于實驗組一和實施例二的支架。表4由此可見實施例一～實施例五的孔隙率均較高。三)、實驗三：復合支架潤濕性的確定1、方法潤濕性主要是通過水滴在其表面形成的接觸角來表征的，本發明通過jc2000c型靜態接觸角測量儀(powereach，上海中晨數字技術設備有限公司，中國)進行復合膜接觸角的測定。2、結論各組別復合支架接觸角的具體值如表5所示，可見，隨著納米珍珠粉比例的增加，復合支架的接觸角變小，即復合支架的潤濕性增加，實施例一的支架潤濕性最差，實施例四、五的支架潤濕性最佳。表5，單位：度四)、實驗四：復合支架抗壓強度的確定1、方法本發明采用ctm8050微機控制電子萬能試驗機(上海協強儀器科技有限公司，中國)進行復合支架抗壓強度的測量。2、結論如表6所示，復合支架的抗壓強度隨著納米珍珠粉比例的增加而顯著增加。表6組別比例樣品1樣品2樣品3實驗組一0％0.1720.1640.155實施例一1％0.2110.2190.225實施例二2.5％0.2920.3090.295實施例三5％0.3120.3480.348實施例四10％0.3390.3990.4實施例五25％0.5750.5750.585五)、實驗五：復合支架晶型的確定1、方法研究表明，文石型珍珠粉比球文石型的珍珠粉能更好地促進細胞的增殖和分化。在本發明中，支架復合的原料為文石型珍珠粉，復合的過程包括混合、攪拌、干燥和消毒。為了檢測復合過程中珍珠粉的晶型是否發生改變，對復合支架用x射線衍射儀進行x射線衍射檢測。2、結論如圖8所示：當納米珍珠粉的比例比較低時，它的特征峰不明顯。當納米珍珠粉的含量超過5％時，它的特征峰出現。在各組別的復合支架中，文石型碳酸鈣為主要的晶型，僅出現少量方解石晶型。六)、實驗六：復合支架的成分確定1、方法紅外光譜是一種分子吸收的光譜，又稱為振動轉動光譜。其原理是，當分子受到紅外光的輻射，產生振動能級的躍遷。當在振動時有偶極矩改變時，就吸收紅外光子，從而形成紅外吸收光譜。紅外光譜法可從分子的特征吸收峰鑒定化合物的分子結構，從而進行物質的定性和定量分析，以定性分析為主。本發明通過傅里葉變換紅外光譜學，檢測分析納米珍珠粉、殼聚糖、透明質酸不同成份分子之間的相互作用。2、結論通過傅里葉紅外光譜檢測實施例一～實施例五、實驗組一復合支架復合過程中各成分間的反應。納米珍珠粉/c-ha復合支架的ftir譜圖，從譜圖可以得到吸收峰的位置、吸收峰的強度和吸收峰的形狀。如圖9～圖18所示：在譜圖中，3600至3200cm-1的峰為o-h的伸縮振動吸收峰。納米珍珠粉(npp)的譜圖中，1488cm-1為c-o伸縮振動吸收峰，860cm-1為co32-彎曲振動吸收峰。殼聚糖(c)的譜圖中，2879cm-1為c-h伸縮振動吸收峰，1650cm-1和1589cm-1處歸屬為酰胺i和酰胺ii兩峰的重疊。1155cm-1為c-o-c反對稱伸縮振動吸收峰，1085cm-1為糖骨架的c-o伸縮振動吸收峰。在透明質酸(h)的譜圖中，2921cm-1為c-h伸縮振動吸收峰，1623cm-1和1413cm-1分別歸屬于coo-的不對稱和對稱伸縮振動吸收峰。1558cm-1為酰胺峰，1155cm-1為c-o-c反對稱伸縮振動吸收峰，1044cm-1處相鄰兩峰分別歸屬為糖骨架上的c-h和c-o-c彈性振動吸收峰。由此可見：透明質酸對復合支架譜圖的影響小于殼聚糖。與殼聚糖的譜圖相比，各比例復合支架中酰胺i峰和酰胺ii峰均發生了藍移，即向短波長移動。與透明質酸的譜圖相比，各比例復合支架中1700至900cm-1的峰強度均減弱。在各比例復合支架的譜圖中，納米珍珠粉、殼聚糖、透明質酸三種成分的峰出現疊加，且隨著納米珍珠粉比例的增加，其特征峰(1488cm-1和860cm-1)逐漸明顯。表明珍珠粉能夠有效的嵌入到聚合物中。三、納米珍珠粉/c-ha復合支架的細胞相容性實驗在骨組織工程的研究中，對支架材料的選擇，細胞相容性是首要的指標之一。雖然珍珠粉、透明質酸、殼聚糖三者都具有良好的生物相容性，但三者復合成支架后的生物相容性尚不清楚。在本發明中，觀察各實施例及實驗組的復合支架上細胞的形態和分布；通過cck-8試驗檢測各組細胞的增殖情況；通過alp試驗檢測各組細胞的分化；通過流式細胞術檢測各組細胞的凋亡；從而評估納米珍珠粉/c-ha復合支架的細胞相容性。1、實驗組實驗組一：與實施例三相比，區別僅在于原料中所含納米珍珠粉的比例為0wt％實施例一～實施例五2、實驗試劑，如表7所示表73、實驗儀器，如表8所示表8一)、實驗七：細胞培養、復合支架上的細胞形態、分布1、方法將制備好的實施例一～實施例五、實驗組一的復合支架用鈷60進行消毒，照射劑量為15kgy。將復合支架浸泡在α-mem基礎培養基(hyclone，美國)中12h后進行細胞培養。將支架放在24孔板中，每孔注入含50,000個細胞的50μl完全培養基，放在37℃、含5％co2的培養箱中培養1h，待細胞貼壁后每孔加入1ml完全培養基進行細胞培養，隔日換液。將細胞在支架上培養7d后，將支架轉移到新的24孔板里，用2.5％戊二醛溶液在4℃固定過夜，用梯度乙醇溶液(0％，30％，50％，75％，95％，100％)脫水，每個濃度脫水兩次，最后用梯度叔丁醇溶液(25％，50％，100％))洗去乙醇。將支架冷凍干燥4h，在掃描電鏡(mira3，捷克)下觀察支架上細胞的形態。將樣本切成3mm寬的薄片，使樣品表面盡量平整。干燥后將樣品依次粘在導電膠上，表面噴金60s。然后打開掃描電鏡的樣品室，將所要觀察的樣品固定，抽真空，用掃描電鏡觀察細胞的形態。2、結論將小鼠mc3t3-e1細胞培養在復合支架上，隔日換液，觀察三維培養條件下細胞的形態。圖19為掃描電鏡下mc3t3-e1細胞的形態，箭頭所示為mc3t3-e1細胞，呈梭形，細胞伸出偽足附在支架上。圖20顯示了mc3t3-e1細胞在支架上的分布，圖中藍色熒光(白點處)為mc3t3-e1細胞的細胞核，淡藍色絮狀物(灰白色絮狀物)為支架材料，細胞在支架上的分布較均勻。復合支架上的mc3t3-e1細胞呈梭形，鋪展情況較好，與在二維培養狀態下細胞的形態相似，表明復合支架具有良好的機械性能，有利于細胞的粘附和生長。mc3t3-e1細胞在支架上分布較均勻，說明mc3t3-e1細胞能在復合支架上生長良好，表明支架具有良好的細胞相容性。二)、實驗八：復合支架上細胞增殖情況的檢測1、方法利用cck-8試劑盒分別于培養第1d、3d、5d、7d檢測支架上細胞的增殖情況，每個樣本設置3個復孔，用分光光度計(bio-radxmarktm，美國)檢測450nm處的吸光度。2、結論于細胞培養第1d、3d、5d和7d通過cck-8測試評估各組細胞的增殖情況，如表9所示。隨著時間的增加，各支架組的mc3t3-e1細胞均增殖明顯。第1d各組間的細胞量無明顯差異。3d后，各組的細胞均迅猛增加，并且隨著納米珍珠粉比例的增加，細胞增殖越明顯，細胞增殖最多的為納米珍珠粉比例為25％的支架組。隨著時間的增加，各支架組mc3t3-e1細胞均增殖明顯，表明復合支架材料具有良好的細胞相容性。隨著納米珍珠粉比例的增加，細胞增殖越明顯，這表明納米珍珠粉能夠有效地促進mc3t3-e1細胞的增殖。第1d各組間的細胞量無明顯差異，這可能是由于mc3t3-e1細胞在初始24h內主要進行貼壁，尚未進行細胞增殖。表9三)、實驗九：復合支架上細胞分化的檢測1、方法堿性磷酸酶能有效評估mc3t3-e1細胞的分化情況。將mc3t3-e1細胞以5×105個/支架的密度種于支架上，用成骨培養基培養28d，分別在0d、7d、14d、28d用堿性磷酸酶測試盒(a059-1，南京建成生物工程研究所)進行檢測。2、結論于細胞培養第1d、7d、14d通過檢測mc3t3-e1細胞的堿性磷酸酶的活性評估各組細胞的分化情況。各組支架材料樣本中細胞懸液，經計算所得各組細胞的堿性磷酸酶活力(mg/gprot)結果如表10所示。隨著時間的增加，堿性磷酸酶的活性增加；隨著納米珍珠粉的增加，堿性磷酸酶的活性逐漸增加，各組間的差異在第7d最明顯。說明復合支架在早期提高了細胞堿性磷酸酶的活性,促進細胞的分化。表10四)、實驗十：復合支架上細胞凋亡的檢測1、方法annexinv是檢測細胞凋亡的靈敏指標之一。它是一種磷脂結合蛋白，可以與早期凋亡細胞的胞膜結合，而細胞質膜的改變是細胞發生凋亡時最早的改變之一。將mc3t3-e1細胞以5×105個/支架的密度種于支架上，培養3d、7d、10d后用胰酶消化后收集，通過annexinv流式細胞術檢測細胞的凋亡情況。2、結論于細胞培養第3d、7d、10d采用流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況。將各組細胞凋亡率統計如表11所示，各組的凋亡率均在正常范圍內，且沒有明顯差異，表明復合支架未促進細胞的凋亡，且不受納米珍珠粉比例的影響。結果表明，納米珍珠粉/c-ha復合支架未促進細胞的凋亡，支架具有無毒性，且不受納米珍珠粉比例的影響。表11綜上所述：小鼠mc3t3-e1細胞成功生長在支架上，且在一定范圍內，高比例的復合支架促進了細胞的增殖和分化，細胞相容性良好。四、納米珍珠粉/c-ha復合支架對成骨相關基因表達、蛋白合成的影響骨一直被認為是一種結構器官。經典理論認為，骨在動物體內起結構支架作用，包含三種類型的細胞：成骨細胞、骨細胞和破骨細胞。成骨細胞來源于骨髓間充質干細胞，能分化為骨細胞。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，其活性可以通過wnt信號通路等多種途徑調節。破骨細胞能吸收骨組織，來源于單核/巨噬細胞系的單核細胞。骨細胞和成骨細胞能分泌一些信號因子，如i型膠原、骨鈣素、骨橋素和runt相關轉錄因子2，來調節成骨細胞和破骨細胞的相互作用，從而進行骨的再生和重建。i型膠原是骨的細胞外基質中主要的蛋白之一。膠原蛋白能夠提供到細胞表面的整合素受體的結合位點，如rgd基序，因此對細胞粘附、細胞存活、遷移和維持組織和器官的物理穩定性都是必不可少的。骨鈣素是一種成骨細胞特異性蛋白，是細胞外基質中的一種主要的非膠原蛋白質。骨鈣素由成骨細胞系合成和分泌，如成骨細胞、骨細胞。大多數的骨鈣素存在于骨基質中，僅有少量存在于血液中，這是因為它對骨基質的親和力較強。它有促成骨和骨形成的功能。成骨細胞能分泌骨鈣素刺激成骨細胞分化和骨細胞的成熟。骨橋素自20多年前第一次被描述以來，在許多生理和病理過程中扮演重要角色，包括生物礦化、組織重塑和炎癥。作為細胞外基質蛋白和促炎癥細胞因子，opn被認為是促進單核細胞和巨噬細胞的募集，并介導白細胞分泌細胞因子。大量體內外研究采用runt相關轉錄因子2過表達來誘導骨髓間充質干細胞進行成骨分化，以及誘導一些成骨相關基因的活性，包括骨鈣素、i型膠原、骨橋素和涎蛋白。有研究證明，c2c12細胞在成骨誘導早期高表達runx2基因；在成熟的成骨細胞中，runx2的表達顯著降低；在成骨細胞分化為骨細胞的過程中，runx2則無法檢測到。因此，runx2可能參與啟動細胞分化為成骨細胞，其表達在后期降低，所以runx2的低表達對成骨細胞功能的維持是至關重要的。在本發明中，通過將無支架的空白對照組和實施例一～實施例五、實驗組一的復合支架組細胞培養0d、3d、7d和14d，進行實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應試驗，檢測各組復合支架對成骨相關基因表達；于培養第0d、3d、7d、14d進行westernblotting試驗，討論納米珍珠粉/c-ha復合支架對成骨相關蛋白合成的影響。1、試劑，如表12所示：表122、儀器如表13所示表133、實驗方案將各組細胞培養在成骨誘導培養基中培養，于培養第0d、3d、7d、14d提取細胞rna采用sybr法進行實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(rt-qpcr)試驗，檢測納米珍珠粉/c-ha復合支架對成骨相關基因表達的影響；于培養第0d、3d、7d、14d進行westernblotting試驗，檢測納米珍珠粉/c-ha復合支架對成骨相關蛋白合成的影響。一)、實驗十一：實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應1、細胞rna的提取2、rna反轉錄3、rt-qpcr的操作1)在ncbi上搜索目的基因colαi、ocn、opn和runx2的序列，引物設計如表14所示：表142)體系組成如表15所示表153)定量pcr擴增程序：將體系混勻，置于熒光定量pcr儀中。95℃×10min預變性后，然后以95℃×15s(變性)，60℃×1min(退火及延伸)為一個循環，進行40個循環。4、結論目的基因colαi、ocn、opn和runx2的相對表達量表16、17、18、19所示：細胞培養當天如表16所示，各組支架目的基因的表達差異無統計學意義。表16細胞培養第3d如表17所示，納米珍珠粉含量為25％的支架組opn和runx2的表達高于空白對照組(p<0.05)，其余各組均無統計學意義。表17細胞培養第7d如表18所示，納米珍珠粉含量為10％和25％的支架組colαi和runx2的表達高于對照組(p<0.05)；納米珍珠粉含量為25％的支架組ocn和opn的表達也高于對照組(p<0.05)。表18細胞培養第14d如表19所示，納米珍珠粉含量為10％和25％的支架組ocn和runx2的表達高于對照組(p<0.05)。表19本發明的rt-qpcr試驗采用sybrgreen法，以β-actin為內參基因，發現納米珍珠粉含量為10％和25％的支架組colαi、ocn、opn和runx2四個基因的表達總體上高于對照組；但納米珍珠粉含量為0％的支架組基因的表達與對照組無統計學差異，說明高比例的納米珍珠粉/c-ha復合支架可能通過上調i型膠原蛋白、骨鈣素、骨橋素和runx2基因的表達促進成骨。二)、實驗十二：westernblotting蛋白質印跡法實驗目的蛋白colαi、ocn、opn和runx2蛋白的相對合成量如表20、21、22、23所示。細胞培養當天如表20所示，納米珍珠粉含量為25％的支架組colαi、ocn和runx2蛋白的合成高于空白對照組(p<0.05)，納米珍珠粉含量為10％的支架組runx2蛋白的合成高于空白對照組(p<0.05)，納米珍珠粉含量為0％的支架組ocn和runx2蛋白的合成高于空白對照組(p<0.05)。表20細胞培養第3d如表21所示，納米珍珠粉含量為25％的支架組colαi和runx2蛋白的合成高于空白對照組(p<0.05)，納米珍珠粉含量為10％的支架組runx2蛋白的合成高于空白對照組(p<0.05)。而關于ocn蛋白，三個比例的納米珍珠粉/c-ha復合支架組的合成均低于空白對照組(p<0.05)，且納米珍珠粉含量為0％的支架組的colαi的合成低于空白對照組(p<0.05)。表21細胞培養第7d如表22所示，納米珍珠粉含量為25％的支架組colαi、ocn、opn和runx2四個蛋白的合成均高于空白對照組(p<0.05)，納米珍珠粉含量為10％的支架組colαi和runx2蛋白的合成高于空白對照組(p<0.05)，納米珍珠粉含量為0％的支架組的ocn的合成高于空白對照組，但opn的合成低于空白對照組(p<0.05)。表22細胞培養第14d如表23所示，納米珍珠粉含量為25％的支架組ocn蛋白的合成高于空白對照組(p<0.05)，納米珍珠粉含量為10％的支架組colαi、ocn和runx2蛋白的合成高于空白對照組(p<0.05)，納米珍珠粉含量為0％的支架組的ocn的合成高于空白對照組(p<0.05)。表23本發明細胞培養第3d，三個比例的納米珍珠粉/c-ha復合支架組ocn蛋白的合成均低于空白對照組(p<0.05)，但是細胞培養第7d，納米珍珠粉含量為0％和25％的支架組ocn蛋白的合成均高于空白對照組(p<0.05)，細胞培養第14d，三個比例的納米珍珠粉/c-ha復合支架組ocn蛋白的合成均高于空白對照組(p<0.05)。ocn蛋白在第3d合成異常，但總體趨勢是復合支架組的合成高于空白對照組。高比例的納米珍珠粉/c-ha支架可能通過上調i型膠原(colαi)的表達，促進細胞外基質的形成。通過膠原蛋白提供的整合素受體的結合位點，促進細胞的粘附、遷移和維持組織和器官的物理穩定性。高比例的納米珍珠粉/c-ha支架可能通過上調骨鈣素ocn的表達，促進骨基質的形成，為小鼠mc3t3-e1的生長提供適宜的細胞外環境。高比例的納米珍珠粉/c-ha支架可能通過上調骨橋素opn的表達，調節成骨細胞和破骨細胞的相互作用，以及各種因子的表達，抑制細胞凋亡。runx2/cbfα1也被稱為多瘤病毒增強子結合蛋白2/核心結合因子或急性髓細胞白血病因子。高比例的納米珍珠粉/c-ha支架可能通過上調runx2的表達，誘導小鼠mc3t3-e1細胞進行成骨分化，誘導colαi、ocn、opn等成骨相關基因的活性。綜上所述：復合支架促進了colαi、ocn、opn和runx2等成骨分化相關基因的表達和蛋白合成。綜合考慮納米珍珠粉的含量在1～20之間的復合支架其形態穩定性好且性能較優，可廣泛使用在骨組織工程方面。所述核苷酸序列表的可讀載體內容為:<110>海口市人民醫院<120>納米珍珠粉c-ha復合支架的制備方法<160>10<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>1ccaaagccagagtggaccctt<210>2<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>2gcttccgtcagcgtcaacacc<210>3<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>3cagaatctccttgcgccaca<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>4attcgtcagattcatccgagt<210>5<211>19<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>5ctgacctcacagatgccaa<210>6<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>6catactggtctgatagctcgt<210>7<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>7gcgacctcaagatgtgccact<210>8<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>8ctctccaaaccagacgtgctt<210>9<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>9catcctgcgtctggacctgg<210>10<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>10taatgtcacgcacgatttcc。對于本領域的技術人員來說，在不脫離本發明技術方案的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發明的保護范圍，這些都不會影響本發明實施的效果和專利的實用性。<110>海口市人民醫院<120>納米珍珠粉c-ha復合支架的制備方法<160>10<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>1ccaaagccagagtggaccctt<210>2<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>2gcttccgtcagcgtcaacacc<210>3<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>3cagaatctccttgcgccaca<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>4attcgtcagattcatccgagt<210>5<211>19<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>5ctgacctcacagatgccaa<210>6<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>6catactggtctgatagctcgt<210>7<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>7gcgacctcaagatgtgccact<210>8<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>8ctctccaaaccagacgtgctt<210>9<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>9catcctgcgtctggacctgg<210>10<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>10taatgtcacgcacgatttcc當前第1頁12