芳香環類藥物在抑制惡性黑色素瘤關鍵轉錄因子方面的應用的制作方法
本發明涉及藥物化學領域，更具體地涉及芳香環類藥物及其在抑制惡性黑色素瘤關鍵轉錄因子mitf方面的應用。
背景技術：
惡性黑色素瘤是起源于黑色素細胞的腫瘤，是最難以治療的惡性腫瘤之一。研究表明，mitf是惡性黑色素瘤中最為重要的直系致癌基因(“thelineagesurvivaloncogeneofmelanoma”)。有家族遺傳史的黑色素瘤患者常攜帶突變mitfe318k，阻礙sumo介導的mitf降解，激活mitf下游基因表達，導致該突變體攜帶者罹患黑色素瘤的可能性較常人高出五倍。mitf過量表達會對mapk信號通路中的抑制劑(包括vrt11e，azd6224，plk4720等黑色素瘤治療研發藥物)產生耐藥性，促進腫瘤復發。抑制mitf可以有效抑制黑色素瘤對其它靶向藥物的耐藥性，增強治療效率，而其本身對身體的其他細胞沒有影響。抑制mitf的蛋白表達可以在細胞水平和小鼠模型中顯著抑制腫瘤的生長。因此，特異靶向mitf的小分子具有抑制惡性黑色素瘤生長，降低抗藥性發生的藥物潛力，能否通過小分子化合物特異有效的靶向mitf一直是該領域的熱點問題。
mitf是含有保守bhlhlz結構域的轉錄因子，而特異靶向轉錄因子的小分子探針研究一直是非常具有挑戰性的熱點研究領域。由于轉錄因子的作用發揮依賴于蛋白相互作用界面(ppi，protein-proteininterface)，一般ppi界面在
因此，本領域迫切需要一種能夠直接靶向mitf且有效抑制惡性黑色素瘤生長、降低抗藥性的小分子化合物。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種能夠直接靶向mitf的小分子化合物，用于治療與mitf相關的疾病，調節mitf參與的生理活動。
本發明的第一方面提供了一種式a所示的化合物、或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽的用途，所述式a所示的化合物用于(a)抑制惡性黑色素瘤關鍵轉錄調控因子(mitf，microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)；(b)治療與mitf相關的疾病；和(c)調節mitf參與的生理活動；
式中，
ar為苯基，吡啶基，嘧啶基、或不含或含有氮、硫、氧雜原子的芳香環；
x1和x2各自獨立地表示選自下組的基團：o原子，s原子，取代或未取代的n原子，c原子；其中所述的取代指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、-oh、-nh2、-cn、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、呋喃、含有o或s的雜原子的取代或未取代的5-7元雜環，所述取代的雜環含有1-3個選自下組的取代基：取代或未取代的苯基、c1-c3烷基、c1-c3鹵代烷基、-oh、-nh2、-cn、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、鹵素、芐基；
r1和r2各自獨立地表示選自下組的基團：鹵素、取代或未取代的c1-c8烷基、取代或未取代的c1-c8烷氧基、取代或未取代的c2-c8烯烴基，取代或未取代的c2-c8炔烴基，取代或未取代的c3-c8環烷基；其中所述的取代指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、-oh、-nh2、-cn、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、呋喃、含有o或s的雜原子的取代或未取代的5-7元雜環，所述取代的雜環含有1-3個選自下組的取代基：取代或未取代的苯基、c1-c3烷基、c1-c3鹵代烷基、-oh、-nh2、-cn、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、鹵素、芐基。
在另一優選例中，所述的式a化合物具有如下結構式：
式中，
ar為吡啶基或苯環；
x1和x2各自獨立地表示選自下組的基團：n原子、o原子、s原子；
r1和r2各自獨立地表示選自下組的基團：
在另一優選例中，所述的式a化合物具有如下結構式：
在另一優選例中，所述的與mitf相關的疾病選自下組：惡性黑色素瘤、胰腺癌，皮膚過敏、哮喘。
在另一優選例中，所述mitf參與的生理活動包括皮膚美白。
本發明的第二方面提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有(a)活性成分，所述活性成分包括如下式a化合物、或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽：
式中，ar、r1、x2、x1和x2如本發明第一方面中所定義；
以及(b)藥學上可接受的載體。
在另一優選例中，所述的藥物組合物或制劑還可含有其他藥物活性成分或藥學上可接受的載體。
在另一優選例中，所述藥物組合物中含有0.001-99wt％，較佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的式a化合物、或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽，按組合物的總重量計。
本發明的第三方面提供了一種如本發明第二方面所述的藥物組合物的用途，所述的藥物組合物用于(a)抑制惡性黑色素瘤關鍵轉錄調控因子(mitf，microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)；(b)治療與mitf相關的疾病；和(c)調節mitf參與的生理活動。
本發明的第四方面提供了一種藥盒，所述的藥盒包括：
(1)第一容器，以及位于所述容器內的第一藥物組合物，所述的第一藥物組合物含有第一化合物、或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體；
(2)第n容器，以及位于所述容器內的第n藥物組合物，所述的第n藥物組合物含有第n化合物、或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體；其中，n為2-8中任一正整數；
其中，第一化合物和第n化合物選自如下所示化合物：
式中，ar、r1、x2、x1和x2如本發明第一方面中所定義；
以及(3)任選的使用說明書。
本發明的第五方面提供了一種體外非治療性的抑制惡性黑色素瘤關鍵轉錄調控因子mitf的方法，所述方法將mitf與式a化合物、或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽進行接觸，從而抑制mitf的活性，其中所述的式a化合物如本發明第一方面中所定義。
本發明的第六方面提供了一種治療惡性黑色素瘤的方法，包括步驟：給需要的對象施用如式a所示的化合物、或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽，或如本發明第二方面所述的藥物組合物，其中所述的式a化合物如本發明第一方面中所定義。
應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附圖說明
圖1.化合物tt-012高效抑制惡性黑色素瘤關鍵調控因子mitf的二體形成。
圖2.化合物tt-012特異抑制mitf的轉錄活性。
圖3.化合物tt-012高效特異抑制mitf依賴的惡性黑色素瘤細胞b16f10的生長。
圖4.化合物tt-012顯著抑制forskolin誘導的黑色素生成。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入地研究，首次發現了一類結構如式a所示芳香類化合物可以以ic50＝10nm的能力高效抑制mitf活性二體形成,顯著地直接抑制mitf的二體形成的活性。實驗表明，所述的式a化合物對mitf有較好的抑制效果。本發明的式a化合物可用于治療與mitf靶點相關的惡性黑色素瘤，胰腺癌，皮膚過敏，哮喘等疾病治療及皮膚美白。在此基礎上，完成了本發明。
術語
術語“c1～c8烷基”指具有1-8個碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、1-丁基、2-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、或類似基團。
術語“c3～c8環烷基”指具有3～8個碳原子的環烷基，例如環丙基、環丁基、環戊基、環庚基、或類似基團。
術語“c1-c3鹵代烷基”指具有1～3個碳原子的直鏈或支鏈并被1～3個鹵素取代烷基。
術語“c1～c8烷氧基”指具有1～8個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或類似基團。
術語“c2～c8烯烴基”指具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈的烯基，例如乙烯基、丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、或類似基團。
術語“c2～c8炔烴基”指具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈的炔基，例如乙炔基、丙炔基、異丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、或類似基團。
術語“5-7元雜環”指具有一個或多個，優選1-3個雜原子的環狀結構，所述的環可以是飽和或不飽和的環。
術語“鹵素”指f、cl、br和i。
如本文所用，術語“含有”或“包括(包含)”可以是開放式、半封閉式和封閉式的。換言之，所述術語也包括“基本上由…構成”、或“由…構成”。
本發明中，術語“藥學上可接受的”成分是指適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)，即有合理的效益/風險比的物質。
惡性黑色素瘤
惡性黑色素瘤是起源于黑色素細胞的腫瘤，是最難以治療的惡性腫瘤之一。研究表明，mitf是惡性黑色素瘤中最為重要的直系致癌基因(“thelineagesurvivaloncogeneofmelanoma”)，同時也是目前治療惡性黑色素瘤最具突破性的靶點之一。20％的惡性皮膚癌患者會存在mitf基因擴增現象，過量表達mitf會誘導黑色素細胞轉化為腫瘤，并促進腫瘤的增殖和分化。
黑色素瘤關鍵轉錄調控因子
黑色素瘤關鍵轉錄調控因子(mitf，microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)是皮膚表皮黑色素細胞的主要調控因子，它的功能是調節黑色素合成酶的轉錄，促進黑色素的生成，傳遞給周圍的皮膚角質細胞，防止由紫外線輻射造成的細胞損傷，同時形成皮膚表面顏色。mitf功能缺失型突變是人類遺傳性白化病疾病waardenburgsyndrometypeiia，tietzsyndrome的主要原因，也是人在衰老過程毛發中變成灰白色的主要原因。
式a化合物
如本文所用，“本發明化合物”、或“式a化合物”可互換使用，指式a所示的化合物、或其消旋體、對應異構體、或其藥學上可接受的鹽。應理解，該術語還包括上述組分的混合物。
式中，各基團的定義如上所述。
在本發明中，還包括式a化合物的藥學上可接受的鹽。術語“藥學上可接受的鹽”指本發明化合物與酸或堿所形成的適合用作藥物的鹽。藥學上可接受的鹽包括無機鹽和有機鹽。一類優選的鹽是本發明化合物與酸形成的鹽。適合形成鹽的酸包括但并不限于：鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有機酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
本發明的式a化合物可采用現有技術中本領域技術人員熟知的方法進行制備，對各個步驟的反應參數沒有特別限制。此外，本發明的典型化合物也可通過市售方式獲得。
除非特別說明，本發明中，所有出現的化合物均意在包括所有可能的光學異構體，如單一手性的化合物，或各種不同手性化合物的混合物(即外消旋體)。本發明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任選地為r構型或s構型，或r構型和s構型的混合物。
用途
本發明的上述式a化合物可用于抑制mitf，進而預防或治療與mitf相關的疾病。
本發明還提供了一種抑制mitf的方法，以及治療與mitf相關的疾病的方法。
在本發明中，與mitf相關的疾病的例子包括(但并不限于)：惡性黑色素瘤，胰腺癌，皮膚過敏，哮喘，皮膚美白等。
在一實施例中，本發明提供了一種體外非治療性的抑制惡性黑色素瘤關鍵轉錄調控因子mitf的方法，包括：例如在體外培養體系中，將惡性黑色素瘤關鍵轉錄調控因子與式a化合物(或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽)進行接觸，從而抑制惡性黑色素瘤關鍵轉錄調控因子mitf的活性。
本發明還提供了一種抑制惡性黑色素瘤關鍵轉錄調控因子mitf的方法，該方法可以是治療性的或非治療性的。通常，該方法包括步驟：給需要的對象施用本發明的式a化合物。優選地，所述對象包括人和非人哺乳動物(嚙齒動物、兔、猴、家畜、狗、貓等)。
組合物和施用方法
由于本發明化合物具有優異的對惡性黑色素瘤關鍵轉錄調控因子(mitf，microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)的抑制活性，因此本發明化合物、或其光學異構體或其外消旋體、或其溶劑化物、或其藥學上可接受的鹽，以及含有以本發明化合物為主要活性成分的藥物組合物可用于治療、預防和緩解與mitf相關的疾病。本發明化合物可用于與mitf相關的疾病如惡性黑色素瘤，胰腺癌，皮膚過敏，哮喘，皮膚美白等的預防和治療。
本發明的藥物組合物包含安全有效量范圍內的本發明化合物或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產生嚴重的副作用。
“藥學上可以接受的載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能和本發明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥學上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如
本發明化合物或藥物組合物的施用方式沒有特別限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤內、直腸、腸胃外(靜脈內、肌肉內或皮下)、和局部給藥。
用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和(i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。
固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且這種組合物中，活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內的某一部分中釋放。可采用的包埋組分的實例是聚合物質和蠟類物質。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
用于口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領域中常規采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質的混合物等。
除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料。
除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質的混合物等。
用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
用于局部給藥的本發明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑。活性成分在無菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時可能需要的推進劑一起混合。
本發明化合物可以單獨給藥，或者與其他藥學上可接受的化合物聯合給藥。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發明化合物適用于需要治療的哺乳動物(如人)，其中施用時劑量為藥學上認為的有效給藥劑量，具體劑量應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
本發明的主要優點包括：
(a)本發明的式a化合物對mitf具有顯著的抑制效果，其抑制mitf二體的ic50值達到10nm。
(b)本發明的典型式a化合物以明確的作用機理靶向mitf。
(c)本發明的式a化合物對于與mitf靶點相關的多種疾病的治療具有良好的開發應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
在具體實施例中，選擇化合物tt-012以更好地說明本發明的內容，所述的化合物tt-012具有如下結構式，其為本發明式a所示化合物中的其中一種化合物：
實施例1
tt-012高效特異抑制mitf二體形成。
在alphascreen高通量篩選模型midas(mitfdependentalpha-screen)中，mitf被分別標記了被alphadonorbeads識別的biotin標簽，和被alphareceptorbeads識別的his標簽。當mitf形成二體時，alphadonorbeads和alphareceptorbeads被牽引靠近，通過680nm激發光和520-620nm發射光進行檢測，便可以監測mitf的二體形成情況。利用midas技術，tt-012可以以ic50＝10nm的能力高效的抑制mitf二體形成(見圖1)。圖1顯示，通過高通量篩選模型midas(mitfdependentalpha-screen)檢測，tt-012可以以ic50＝10nm高效的抑制mitf二體形成(正方形標注)，而對對照試驗,lysrs-p38相互作用的alphascreen信號沒有影響(三角形標注)。
實施例2
tt-012特異抑制mitf的轉錄活性
將tt-012與黑色素瘤細胞b16f10細胞系孵育，通過mrna抽提，逆轉錄實驗，熒光定量pcr檢測mitf標志性下游基因-tyr(酪氨酸酶)和(trpm1瞬時受體電位陽離子通道m1)的轉錄情況。通過rt-pcr實驗，tt-012可以以ic50＝2μm高效抑制mitf標志性下游基因-tyr和trpm1的mrna水平。圖2顯示活性tt-012可以顯著抑制mitf下游基因轉錄影響。
實施例3
tt-012特異抑制惡性黑色素瘤的生長
將活性tt012與mitf依賴并高表達的黑色素瘤細胞系b16f10，mitf低表達的a375黑色素瘤細胞系，和對照細胞系hela孵育，通過mtt實驗檢測細胞活性，從圖3中可以發現，通過mtt實驗，tt-012以ic50＝300nm的高效能抑制mitf依賴的惡性黑色素瘤細胞b16f10的生長(正方形標注)，而對mitf低表達的惡性黑色素瘤細胞a375(圓形標注)以及對照細胞hela(三角形標注)沒有殺傷能力。說明tt-012有特異抑制mitf活性并抑制mitf依賴的惡性黑色素瘤生長的性質。
實施例4
tt-012特異抑制黑色素的形成
mitf調控黑色素合成酶tyr，tyrp1的轉錄表達，是黑色素形成的主要調控因子。小分子化合物foskolin可以通過激活msh-camp-creb調節通路，促進mitf表達，進而促進黑色素的生成。從圖4中可以看出，tt-012可以通過抑制mitf,高效抑制黑色素的形成，具有良好的皮膚美白潛力。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
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