本發明屬于醫療
技術領域：
，具體涉及一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑及其制備方法。
背景技術：
：齲齒被世界衛生組織(who)列為危害人類健康的三大慢性非傳染性疾病之一，也是兒童的常見病、多發病。細菌感染是牙髓病和根尖周病的主要發病病因，其中以革蘭氏厭氧菌為主要致病菌群，檢出率高達98.33％。目前，齲齒的治療主要通過祛腐、殺菌、填充等幾步完成，其中祛腐的方法有車針祛腐和化學機械祛腐兩種。現在化學機械法使用的試劑主要由次氯酸鈉溶液和氨基酸凝膠兩部分組成，臨用前混合后使用。但是，上述試劑在保存過程中存在穩定性較差的問題，不能滿足治療的要求。另外，由于口腔內細菌的作用，特別是長期吸煙、喝茶、喝咖啡等，易使污漬附著在牙齒表面，形成牙漬。牙漬不僅影響美容、美觀，而且利于細菌進一步的生成繁殖，產生破壞牙本質的酸性物質，形成蛀牙，最終可使牙整體壞死，嚴重影響人們的牙齒健康。木瓜蛋白酶是一種含疏基的肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶活性，在酸性、中性、堿性環境下均能分解蛋白質，有較廣泛的特異性，在醫藥、食品、化妝品等多個領域均已有應用，是一種安全有效的食物蛋白酶。專利文獻cn103800210a公開了一種含蛋白酶的牙科、口腔科制劑及其制備方法，所述制劑主要由氯胺-t和蛋白酶組成，該制劑可用于牙根管沖洗或齲齒祛腐，以及齒科美白、治療小的口腔潰瘍等。專利文獻wo2005020946a1公開了一種化學組合物及其用于去除齲齒組織的方法，所述組合物由木瓜蛋白酶、氯胺-t、羧甲基纖維素、氯化鈉、羥苯甲酯、氫氧化鈉等組分組成，該化學組合物將木瓜蛋白酶與氯胺-t聯合使用可以用于齲齒的治療。然而，目前的去除齲齒的制劑均含有氯胺-t成分，該成分在使用的過程中會接觸皮膚，經皮吸收后對人體具有較大的危害性，例如：會產生皮膚過敏，發紅，水皰，在吸入呼吸道后易產生哮喘、呼吸困難等癥狀，會對人體產生嚴重的影響。同時，l.e.bertassoniandg.w.marshall在威利期刊公司(wileyperiodicals,inc.)發表了一篇題目為“papain-geldegradesintactnonmineralizedtypeicollagenfibrils(木瓜蛋白酶凝膠可降解完整的非礦化i型膠元纖維)”的文章(scanningvol.31,253–258(2009))，該文章表明：牙本質的微觀基本結構是i型膠元纖維，經試驗發現木瓜蛋白酶凝膠可部分降解完整的i型膠元纖維，即木瓜蛋白酶對牙i型膠元仍有一定的“傷害”作用。因此，研究和開發一種可以用于齲齒祛腐，齒科美白，而且對牙齒沒傷害的口腔制劑仍是目前亟需解決的難題。技術實現要素：為了解決現有技術中去除齲齒口腔制劑存在的不足，本發明的目的在于提供一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑及其制備方法。本發明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑具有顯著殺菌、祛腐、美白的作用，對齲齒具有顯著的治療效果。本發明提供了一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑，包括以下組分及其重量百分比：改性木瓜蛋白酶4～14％、檸檬酸8～12％、卡波姆1～4％和蒸餾水70～87％。進一步地，所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑，包括以下組分及其重量百分比：改性木瓜蛋白酶8％、檸檬酸10％、卡波姆2％和蒸餾水80％。進一步地，所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1取木瓜蛋白酶，加入濃度為90～100μmol/l的二酰胺溶液，靜置10～15min，得修飾木瓜蛋白酶；s2將步驟s1得到的修飾木瓜蛋白酶，加入濃度為0.02～0.06mol/l，ph值為7～8的tris-鹽酸緩沖液，于室溫下邊攪拌邊加入氯化鈉至飽和狀態使游離酶沉淀，靜置25～35min后，離心，取沉淀物，得修飾木瓜蛋白酶聚體；s3取步驟s2得到的修飾木瓜蛋白酶聚體加入質量分數為10～20％的聚乙二醇400溶液，于4℃條件下交聯10～14h，即得。進一步地，所述步驟s1中木瓜蛋白酶與二酰胺溶液的固液比為1mg：8～12ml。進一步地，所述步驟s2中修飾木瓜蛋白酶與tris-鹽酸緩沖液的固液比為1mg：1～2ml。進一步地，所述步驟s3中修飾木瓜蛋白酶聚體與聚乙二醇400溶液的固液比為1mg：3～5ml。進一步地，所述卡波姆為卡波姆940，所述卡波姆940為口服級別和醫藥級別卡波姆。進一步地，所述卡波姆為成凝膠物質，但不僅限卡波姆，亦可選用其它成凝膠物質，如羧甲基纖維素鈉、羥丙甲基纖維素、透明質酸鈉、殼聚糖等成分；優選為羧甲基纖維素鈉和羥丙甲基纖維素。另外，本發明還提供了一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法，包括以下步驟：將改性木瓜蛋白酶溶于蒸餾水中，接著加入檸檬酸和卡波姆攪拌溶解后，加入ph值調節劑調節ph值至4～8，即得。進一步地，所述ph值調節劑為10％(w/v)氫氧化鈉溶液。本發明采用二酰胺溶液對木瓜蛋白酶進行處理，將木瓜蛋白酶的巰基(-sh)氧化為二硫鍵(-s-s-)形式，接著將上述氧化后的木瓜蛋白酶加入聚乙二醇400溶液進行交聯，從而改變木瓜蛋白酶的活性和穩定性，同時，該改性木瓜蛋白酶還可以降低木瓜蛋白酶對膠元纖維表層的降解作用。經試驗發現，本發明提供的改性木瓜蛋白酶的制備方法制備得到的改性木瓜蛋白酶的酶活力大于11840μ/g，具有較高的酶活性，可以有效的提高木瓜蛋白酶的殺菌、祛腐、美白的作用，對齲齒具有顯著的治療效果。進一步地，經試驗發現，本發明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑對正常牙本質涂布3次后，其牙本質的組織彈性模量(e)和硬度(h)基本無變化，說明本發明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑不會影響牙本質的機械性能，是一種安全，高效的治療齲齒口腔凝膠劑。進一步地，本發明采用檸檬酸與卡波姆聯合使用，不僅可以提高凝膠劑的抑菌能力，延長含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的保護期限，同時，該檸檬酸還可以降低卡波姆的吸濕性，解決卡波姆吸濕后易于結塊導致溶解困難的缺陷。經試驗發現，本發明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑在溫度為25±2℃，相對濕度為60％±10％的條件下保存6個月，其外觀、重量差異、微生物限度均符合規定，具有較高的穩定性。另外，本發明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的劑成分簡單，美白去腐作用顯著，生產成本低，是一種適合規模化生產的口腔凝膠劑，為廣大齲齒患者帶來福音。與現有技術相比，本發明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑具有以下優勢：(1)本發明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑具有顯著殺菌、祛腐、美白、治療小的口腔潰瘍等作用，對齲齒具有顯著的治療效果；(2)本發明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑不會影響牙本質的機械性能，是一種安全，高效的治療齲齒口腔凝膠劑。具體實施方式：以下通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。本發明的組分為常規的市售組分，而且都是食品級組分，對人體無毒副作用。實施例1、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑由以下組分及其重量百分比組成：改性木瓜蛋白酶4％、檸檬酸12％、卡波姆9404％和蒸餾水80％；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1取木瓜蛋白酶，加入濃度為90μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶與二酰胺溶液的固液比為1mg：8ml；靜置10min，得修飾木瓜蛋白酶；s2將步驟s1得到的修飾木瓜蛋白酶，加入濃度為0.02mol/l，ph值為7的tris-鹽酸緩沖液，上述修飾木瓜蛋白酶與tris-鹽酸緩沖液的固液比為1mg：1ml，于室溫下邊攪拌邊加入氯化鈉至飽和狀態使游離酶沉淀，靜置25min后，離心，取沉淀物，得修飾木瓜蛋白酶聚體；s3取步驟s2得到的修飾木瓜蛋白酶聚體加入質量分數為10％的聚乙二醇400溶液，上述修飾木瓜蛋白酶聚體與聚乙二醇400溶液的固液比為1mg：3ml；于4℃條件下交聯10h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法：將改性木瓜蛋白酶溶于蒸餾水中，接著加入檸檬酸和卡波姆940攪拌溶解后，加入ph值調節劑調節ph值至6，所述ph值調節劑為10％(w/v)氫氧化鈉溶液，即得。實施例2、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑由以下組分及其重量百分比組成：改性木瓜蛋白酶8％、檸檬酸10％、卡波姆9402％和蒸餾水80％；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1取木瓜蛋白酶，加入濃度為95μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶與二酰胺溶液的固液比為1mg：10ml；靜置12min，得修飾木瓜蛋白酶；s2將步驟s1得到的修飾木瓜蛋白酶，加入濃度為0.04mol/l，ph值為7.5的tris-鹽酸緩沖液，上述修飾木瓜蛋白酶與tris-鹽酸緩沖液的固液比為1mg：1ml，于室溫下邊攪拌邊加入氯化鈉至飽和狀態使游離酶沉淀，靜置30min后，離心，取沉淀物，得修飾木瓜蛋白酶聚體；s3取步驟s2得到的修飾木瓜蛋白酶聚體加入質量分數為15％的聚乙二醇400溶液，上述修飾木瓜蛋白酶聚體與聚乙二醇400溶液的固液比為1mg：4ml；于4℃條件下交聯12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法與實施例1類似。實施例3、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑由以下組分及其重量百分比組成：改性木瓜蛋白酶14％、檸檬酸8％、卡波姆9401％和蒸餾水77％；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1取木瓜蛋白酶，加入濃度為100μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶與二酰胺溶液的固液比為1mg：12ml；靜置15min，得修飾木瓜蛋白酶；s2將步驟s1得到的修飾木瓜蛋白酶，加入濃度為0.06mol/l，ph值為8的tris-鹽酸緩沖液，上述修飾木瓜蛋白酶與tris-鹽酸緩沖液的固液比為1mg：2ml，于室溫下邊攪拌邊加入氯化鈉至飽和狀態使游離酶沉淀，靜置35min后，離心，取沉淀物，得修飾木瓜蛋白酶聚體；s3取步驟s2得到的修飾木瓜蛋白酶聚體加入質量分數為20％的聚乙二醇400溶液，上述修飾木瓜蛋白酶聚體與聚乙二醇400溶液的固液比為1mg：5ml；于4℃條件下交聯14h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法與實施例1類似。實施例4、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑由以下組分及其重量百分比組成：改性木瓜蛋白酶8％、檸檬酸10％、羧甲基纖維素鈉2％和蒸餾水80％；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1取木瓜蛋白酶，加入濃度為95μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶與二酰胺溶液的固液比為1mg：10ml；靜置12min，得修飾木瓜蛋白酶；s2將步驟s1得到的修飾木瓜蛋白酶，加入濃度為0.04mol/l，ph值為7.5的tris-鹽酸緩沖液，上述修飾木瓜蛋白酶與tris-鹽酸緩沖液的固液比為1mg：1ml，于室溫下邊攪拌邊加入氯化鈉至飽和狀態使游離酶沉淀，靜置30min后，離心，取沉淀物，得修飾木瓜蛋白酶聚體；s3取步驟s2得到的修飾木瓜蛋白酶聚體加入質量分數為15％的聚乙二醇400溶液，上述修飾木瓜蛋白酶聚體與聚乙二醇400溶液的固液比為1mg：4ml；于4℃條件下交聯12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法：將改性木瓜蛋白酶溶于蒸餾水中，接著加入檸檬酸和羧甲基纖維素鈉攪拌溶解后，加入ph值調節劑調節ph值至6，所述ph值調節劑為10％(w/v)氫氧化鈉溶液，即得。對比例1、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的組分及其重量百分比如實施例2；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1取木瓜蛋白酶，加入濃度為95μmol/l的5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液，上述木瓜蛋白酶與二酰胺溶液的固液比為1mg：10ml；靜置12min，得修飾木瓜蛋白酶；s2將步驟s1得到的修飾木瓜蛋白酶，加入濃度為0.04mol/l，ph值為7.5的tris-鹽酸緩沖液，上述修飾木瓜蛋白酶與tris-鹽酸緩沖液的固液比為1mg：1ml，于室溫下邊攪拌邊加入氯化鈉至飽和狀態使游離酶沉淀，靜置30min后，離心，取沉淀物，得修飾木瓜蛋白酶聚體；s3取步驟s2得到的修飾木瓜蛋白酶聚體加入質量分數為15％的聚乙二醇400溶液，上述修飾木瓜蛋白酶聚體與聚乙二醇400溶液的固液比為1mg：4ml；于4℃條件下交聯12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法與實施例1類似。與實施例2的區別在于，所述步驟s1中將二酰胺溶液替換為5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液。對比例2、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的組分及其重量百分比如實施例2；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1將木瓜蛋白酶，加入濃度為0.04mol/l，ph值為7.5的tris-鹽酸緩沖液，上述木瓜蛋白酶與tris-鹽酸緩沖液的固液比為1mg：1ml，于室溫下邊攪拌邊加入氯化鈉至飽和狀態使游離酶沉淀，靜置30min后，離心，取沉淀物，得木瓜蛋白酶聚體；s2取步驟s1得到的木瓜蛋白酶聚體加入質量分數為15％的聚乙二醇400溶液，上述木瓜蛋白酶聚體與聚乙二醇400溶液的固液比為1mg：4ml；于4℃條件下交聯12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法與實施例1類似。與實施例2的區別在于，沒有對木瓜蛋白酶進行二酰胺溶液處理。對比例3、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的組分及其重量百分比如實施例2；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1取木瓜蛋白酶，加入濃度為95μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶與二酰胺溶液的固液比為1mg：10ml；靜置12min，得修飾木瓜蛋白酶；s2將步驟s1得到的修飾木瓜蛋白酶，加入濃度為0.04mol/l，ph值為7.5的tris-鹽酸緩沖液，上述修飾木瓜蛋白酶與tris-鹽酸緩沖液的固液比為1mg：1ml，于室溫下邊攪拌邊加入氯化鈉至飽和狀態使游離酶沉淀，靜置30min后，離心，取沉淀物，得修飾木瓜蛋白酶聚體；s3取步驟s2得到的修飾木瓜蛋白酶聚體加入質量分數為15％的戊二醇溶液，上述修飾木瓜蛋白酶聚體與聚乙二醇400溶液的固液比為1mg：4ml；于4℃條件下交聯12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法與實施例1類似。與實施例2的區別在于，所述步驟s3中將聚乙二醇400溶液替換為戊二醇溶液。對比例4、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的組分及其重量百分比如實施例2；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法為：s1取木瓜蛋白酶，加入濃度為95μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶與二酰胺溶液的固液比為1mg：10ml；靜置12min，得修飾木瓜蛋白酶。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法與實施例1類似。與實施例2的區別在于，沒有對木瓜蛋白酶進行交聯處理。對比例5、一種含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑由以下組分及其重量百分比組成：改性木瓜蛋白酶10％、卡波姆9404％和蒸餾水86％；所述改性木瓜蛋白酶的制備方法與實施例2類似。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的制備方法與實施例1類似。與實施例2的區別在于，所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑不含有檸檬酸。試驗例一、改性木瓜蛋白酶的活性測試試驗1、試驗材料：采用實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4的改性木瓜蛋白酶的制備方法制備得到的改性木瓜蛋白酶，ultrospec2100型紫外分光光度計。2、試驗方法：采用國際gb/t23527-2009規定的方法進行測定，其中是以酪蛋白為底物，測定改性木瓜蛋白酶的酶活性，酶活力單位定義為：在測定條件下每分鐘水解酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在280nm處的消光值相當于濃度為1μg/ml酪氨酸消光時所需的酶量，為一個酶活力單位(u)。稱取采用實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4的改性木瓜蛋白酶的制備方法制備得到的改性木瓜蛋白酶1.0005g，稀釋倍數為250，計算改性木瓜蛋白酶的酶活力。3、試驗結果試驗結果如表1所示。表1改性木瓜蛋白酶的活性測試試驗數據組別吸光度酶活力(μ/g)實施例1組0.70811560實施例2組0.73513035實施例3組0.69910840實施例4組0.67110345對比例1組0.6208207對比例2組0.5997351對比例3組0.6448524對比例4組0.6018036由表1可知，采用本發明實施例1、實施例2和實施例3的改性木瓜蛋白酶的制備方法制備得到的改性木瓜蛋白酶的酶活力大于11840μ/g，而對比例1-4組制備得到的改性木瓜蛋白酶的酶活力與本發明實施例1-3相比，至少降低了32％。說明本發明將木瓜蛋白酶先進行二酰胺溶液處理，接著進行聚乙二醇400溶液交聯，可以有效的提高木瓜蛋白酶的酶活性。試驗例二、含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑對牙齒的影響試驗1、試驗材料：實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑。2、試驗方法：參考l.e.bertassoniandg.w.marshall在威利期刊公司(wileyperiodicals,inc.)發表的題目為“papain-geldegradesintactnonmineralizedtypeicollagenfibrils(木瓜蛋白酶凝膠可降解完整的非礦化i型膠元纖維)”的文章(scanningvol.31,253–258(2009))中的方法對健康牙本質進行機械性能測試，檢測并記錄第3次涂布凝膠后的牙本質的組織彈性模量(e)和硬度(h)。3、試驗結果：試驗結果如表2所示。表2含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑對牙齒的影響試驗組別eh(gpa)正常牙本質組19.8±2.10.8±0.09實施例1組18.4±2.20.72±0.08實施例2組19.6±1.90.76±0.1實施例3組18.1±2.30.71±0.09實施例4組17.4±2.20.65±0.13對比例1組11.9±1.9**0.31±0.12**對比例2組10.2±2.4**0.45±0.2**對比例3組13.7±2.5**0.28±0.1**對比例4組10.9±2.3**0.36±0.2**注：與正常牙本質組相比**p＜0.01。由表2可知，本發明實施例1、實施例2和實施例3制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑對正常牙本質涂布3次后，其牙本質的機械性能基本無變化，而對比例1-4制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑對正常牙本質涂布3次后，與正常牙本質組相比，其牙本質的組織彈性模量(e)和硬度(h)極顯著(p＜0.01)的降低，說明本發明提供的改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑對牙齒沒有傷害作用，具有較高的安全性，適合長期使用。試驗例三、含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的穩定性試驗1、試驗材料：實施例2和對比例5制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑。2、試驗方法：將實施例2和對比例5制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑采用鋁箔袋+紙盒包裝，在溫度為25±2℃，相對濕度為60％±10％，進行6個月溫室留樣試驗，對樣品的外觀、重量差異、微生物限度進行考察測定。3、試驗結果：試驗結果如表3和表4所示。表3實施例2制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的穩定性試驗表4對比例5制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑的穩定性試驗由表3和表4可知，本發明制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑在溫度為25±2℃，相對濕度為60％±10％的條件下保存6個月，其外觀、重量差異、微生物限度均符合規定，具有較高的穩定性。而沒有添加檸檬酸的對比例5制備得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝膠劑在溫度為25±2℃，相對濕度為60％±10％的條件下保存6個月后開始出現質量問題，嚴重影響口腔凝膠劑的功效。當前第1頁12