一種水生生物源交聯膠原蛋白復合多層醫用敷料的制作方法

本發明屬于醫用材料技術領域，具體涉及一種水生生物源交聯膠原蛋白復合多層醫用敷料。

背景技術：

膠原蛋白是一種來源廣泛、低免疫原性、生物相容性好的天然可降解生物大分子，其具有優良的止血性能，對凝血功能障礙的患者也具有良好的止血作用，且能夠促進肉芽組織的再生和修復，能促進創傷愈合。多年來的臨床實踐表明，傳統的物理、化學、機械的止血方法均存在著一定的局限性和不良反應，而諸如膠原蛋白類的天然高分子物質醫用敷料是一種有效的外科止血方式。膠原蛋白可以適用于各種實質性臟器、體表和骨組織、血管組織以及結締組織的止血。美國ims公司對傷口敷料類產品進行市場調查，可吸收止血劑占據了整個敷料類市場份額的75％，而膠原蛋白基生物醫用敷料是可吸收止血劑的很大組成部分。從1983年膠原止血海綿問世以來，將膠原蛋白作為一種可降解的止血、愈創材料基質的研究已成為國內外的熱點。

目前，用于生物醫用材料的膠原蛋白主要來源于陸生動物，例如豬皮、牛跟腱和鼠尾，而由于口蹄疫、瘋牛病等疾病的傳播和宗教信仰的限制，從水生生物中尋找醫用膠原蛋白作為替代來源則變得越來越重要。目前國內廣泛應用的止血、愈創醫用敷料質量參差不齊，都有各自的不足之處，國外的醫用敷料因其高昂的價格限制了其廣泛應用。至今仍然沒有一種理想的水生生物源膠原蛋白基止血、愈創醫用敷料能夠同時解決膠原蛋白的應用瓶頸。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種水生生物源交聯膠原蛋白復合多層醫用敷料，從而解決天然膠原蛋白敷料機械強度差、抗降解能力弱、傷口易受微生物感染的問題。

本發明首先提供一種改性膠原蛋白海綿，其制備方法如下：

1)高純度高活性醫用膠原蛋白的制備：

將魚皮用刀片刮去魚鱗、殘肉和脂肪，冷水洗凈，用切片機切成0.5–1cm²的小塊。魚皮經超高壓處理以提高膠原蛋白的提取率，壓力為100–300mpa，處理時間為5–20min。將魚皮浸泡于0.5％–10％的tritonx-100的磷酸緩沖液中，置于振蕩器上震蕩12–48h，60–200rpm，4℃，在蒸餾水中震蕩漂洗，再將魚皮浸泡于1％–5％的sds磷酸緩沖液中，置于振蕩器上震蕩12–48h，60–200rpm，4℃，在蒸餾水中震蕩漂洗，重復上述步驟3次以脫除組織中的細胞；加入0.1mnaoh溶液浸泡除去非膠原成分及色素，蒸餾水反復洗至中性；加入110％正丁醇溶液攪拌去除脂肪，蒸餾水反復洗滌。使用組織搗碎機充分攪碎后，加入含0.5％(w/w)胃蛋白酶的0.5m醋酸中進行提取48h，離心(9,000–15,000rpm,30min，4℃)，所得上清液為膠原蛋白粗提液，再經研細的nacl鹽析，至溶液中nacl最終濃度為0.9m，靜置一夜，9,000rpm離心30min,收集沉淀溶于0.5m醋酸中，經二次鹽析后的膠原蛋白復溶于0.5m醋酸中，溶液對0.02m的磷酸氫二鈉溶液透析至ph≥8進行滅酶，再對蒸餾水透析除鹽，直至透析外液用硝酸銀溶液檢測無氯離子即為透析終點；透析后的膠原蛋白溶液用0.22或0.45μm的板式膜進行除菌，最后用活性炭進行脫色，離心后去除活性炭獲得高純度高活性的醫用膠原蛋白，低溫真空冷凍干燥；

2)內層多孔膠原蛋白海綿的制備：

將步驟1)制備的高純度高活性醫用膠原蛋白溶于0.1m–0.5m的醋酸溶液中，配制成質量百分比濃度為0.5％–1％的膠原蛋白溶液，采用真空脫泡和低溫低速離心(3,000–5,000rpm,5–10min，4℃)并用的脫泡方式脫泡，再將處理的溶液零下40℃預冷凍24h–36h，零下38℃冷凍干燥24h–48h制成厚度為3mm的內層多孔膠原蛋白海綿；

3)內層膠原蛋白海綿交聯改性：

將步驟2)所制備的內層多孔膠原蛋白海綿進行改性處理，得到改性的內層膠原蛋白海綿；

所述的改性方法，其一種方法是將內層多孔膠原蛋白海綿置于真空干燥箱中，在常溫下抽真空，然后升溫至110℃–130℃，加熱脫水1–3d完成改性；

其再一種的改性方法，是將膠原蛋白海綿放入等離子體處理儀的反應腔內，抽真空，待壓強至50–200pa時，在功率為80–120w下，放電處理5–10min完成改性；

再一種改性方法，將膠原蛋白海綿浸泡于化學交聯劑進行交聯，交聯結束后除去殘余交聯劑后，低溫真空冷凍干燥完成改性；

所述的化學交聯劑，為戊二醛、碳二亞胺鹽酸鹽/羥基琥珀酰亞胺、京尼平交聯、茶多酚、去甲二氫愈創木二酸或疊氮二苯基磷。

本發明所提供的改性膠原蛋白海綿用于制備醫用敷料；

本發明再一個方法提供一種水生生物源交聯膠原蛋白復合多層醫用敷料，其制備方法如下：

1)外層殼聚糖膜的制備：

將脫乙酰度不小于80％的殼聚糖配制成質量分數為1％–20％的醋酸溶液，真空脫泡后，于50℃真空干燥制成厚度為2mm的膜；

2)內、外層點膠復合：

在步驟1)制備的外層殼聚糖膜的一側涂布聚丙烯酸酯類生物膠，使改性膠原蛋白海綿和外層殼聚糖膜進行復合制成內外復合層；

3)復合多層敷料的制備：

在內外復合層上貼附上基布層，滅菌后制成復合多層敷料。

所述的基布層為醫用無紡布，將無紡布的一側涂布醫用壓敏熱熔膠，使復合敷料的內外層與基布層復合。

本發明的優點和有益效果如下：

1.本發明制備的復合多層醫用敷料的主要原料膠原蛋白來源廣泛，由陸生動物變為水生生物，提高了魚類下腳料的綜合利用率，實現了水產品資源的高值化利用。

2.本發明中膠原蛋白的提取純化工藝成熟，可以制備出高純度高活性的具有完整三螺旋結構的i型醫用膠原蛋白。

3.本發明中制備的內層膠原蛋白海綿色澤潔白，具有孔隙均勻的網絡狀結構，有利于組織滲出液的吸收并提高止血性能。

4.本發明中使用物理和化學交聯的方法對膠原蛋白海綿進行改性，使其機械性能和抗酶降解能力顯著提高。

5.本發明將膠原蛋白與殼聚糖復合，實現了復合材料的優勢互補作用。

6.本發明制備的復合多層醫用敷料兼具了內層膠原蛋白多孔海綿的止血、促進傷口愈合、吸收組織滲出液、促進細胞生長的功效和外層殼聚糖膜的抵御細菌侵入、保持傷口的濕潤環境等功效以及無紡布基布層的固定和支撐作用，是一種新型的高性能的醫用敷料，相比于傳統醫用敷料，其具有優良的止血效果，有利于促進傷口愈合，解決了單一膠原蛋白敷料機械強度差、抗降解能力弱、傷口易受微生物感染、易引起炎癥反應等一系列問題。

附圖說明

圖1為實施例1制備的醫用膠原蛋白的sds-page圖譜。泳道1：蛋白質標準品；泳道2：加β-巰基乙醇；泳道3：不加β-巰基乙醇；泳道4：sykes還原法；

圖2為實施例1制備的醫用膠原蛋白的傅里葉紅外光譜圖；

圖3為實施例1制備的醫用膠原蛋白的圓二色譜圖；

圖4為內層膠原蛋白海綿的表觀圖(a)和掃描電鏡圖：表面(b)、橫截面(c)、縱截面(d)。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。

實施例1

水生生物源交聯膠原蛋白復合多層醫用敷料的制備方法，步驟如下：

(1)高純度高活性醫用膠原蛋白的制備：羅非魚皮用刀片刮去魚鱗、殘肉和脂肪，冷水洗凈，用切片機切成0.5–1cm²的小塊。魚皮經超高壓處理以提高膠原蛋白的提取率，壓力為200mpa，處理時間為5min。將魚皮浸泡于2％的tritonx-100的磷酸緩沖液中，置于振蕩器上震蕩48h，100rpm，4℃，在蒸餾水中震蕩漂洗，再將魚皮浸泡于1％的sds磷酸緩沖液中，置于振蕩器上震蕩48h，100rpm，4℃，在蒸餾水中震蕩漂洗，重復上述步驟3次以脫除組織中的細胞。加入0.1mnaoh溶液(1:20,w/v)浸泡24h除去非膠原成分及色素，蒸餾水反復洗至中性。加入10倍體積10％正丁醇溶液攪拌48h，以去除脂肪，蒸餾水反復洗滌。使用組織搗碎機充分攪碎后，加入含0.5％(w/w)胃蛋白酶的0.5m醋酸(1:50,w/v)提取48h，離心(10,000rpm,30min，4℃)，所得上清液為膠原蛋白粗提液，再經研細的nacl鹽析，至溶液中nacl最終濃度為0.9m，靜置一夜，9,000rpm離心30min,收集沉淀溶于0.5m醋酸中，經二次鹽析后的膠原蛋白復溶于0.5m醋酸中，溶液對0.02m的磷酸氫二鈉溶液透析至ph≥8進行滅酶，再對蒸餾水透析除鹽，直至透析外液用硝酸銀溶液檢測無氯離子即為透析終點。透析后的膠原蛋白溶液用0.22μm的板式膜進行除菌，最后經1％(w/v)的藥用活性炭脫色和除熱源，離心后去除活性炭獲得高純度高活性的醫用膠原蛋白，低溫真空冷凍干燥。

(2)內層多孔膠原蛋白海綿的制備：將上述高純度高活性醫用膠原蛋白溶于0.5m的醋酸溶液中，按質量百分比，配制成濃度為1％的膠原蛋白溶液，磁力攪拌器攪拌至完全溶解，采用真空脫泡和低溫低速離心(5,000rpm,5min，4℃)并用的脫泡方式脫泡，倒入六孔板模具中，厚度為3mm，低溫預冷凍24h，冷凍干燥48h。

(3)內層膠原蛋白海綿交聯改性：將膠原蛋白海綿浸入磷酸鹽緩沖液(0.054mna2hpo4,0.013mnah2po4,ph7.4)，加入gta使其濃度為1％，于室溫下交聯3d，用蒸餾水沖洗，后用新配制的1.2mg/mlnabh4磷酸鹽緩沖液(ph7.4)清洗60min，再用0.2m甘氨酸溶液處理24h，以處理未反應的醛基，最后用4mnacl溶液沖洗60min，蒸餾水反復清洗。低溫預冷凍24h，冷凍干燥48h。

所述的改性方法，其一種方法是將內層多孔膠原蛋白海綿置于真空干燥箱中，在常溫下抽真空，然后升溫至110℃–130℃，加熱脫水1–3d完成改性；

其再一種的改性方法，是將膠原蛋白海綿放入等離子體處理儀的反應腔內，抽真空，待壓強至50–200pa時，在功率為80–120w下，放電處理5–10min完成改性；

再一種改性方法，將膠原蛋白海綿浸泡于化學交聯劑進行交聯，交聯結束后除去殘余交聯劑后，低溫真空冷凍干燥完成改性；

具體如下：

1、戊二醛(gta)交聯：將膠原蛋白海綿浸入磷酸鹽緩沖液(0.054mna2hpo4,0.013mnah2po4,ph7.4)，加入gta使其濃度為0.25％–2％，于室溫下交聯1–3d，用蒸餾水沖洗，后用新配制的1.2mg/mlnabh4磷酸鹽緩沖液(ph7.4)清洗60min，再用0.2m甘氨酸溶液處理24h，以處理未反應的醛基，最后用4mnacl溶液沖洗60min，蒸餾水反復清洗。

2、碳二亞胺鹽酸鹽/羥基琥珀酰亞胺(edc/nhs)交聯：將膠原蛋白海綿浸泡于ph為5.5的含50mm2-n-嗎啉已烷磺酸(mes)的40％乙醇中60min，再將其浸泡在含50mmmes、20–100mmedc、8–40mmnhs(nedc:nnhs＝2.5:1)的40％乙醇(ph5.5)中，室溫下交聯2–24h，用0.1mna2hpo4清洗，再分別用1m、2m、4mnacl溶液清洗，最后用蒸餾水反復清洗。

3、京尼平交聯：將膠原蛋白海綿浸入磷酸鹽緩沖液(0.054mna2hpo4,0.013mnah2po4,ph7.4)或30％乙醇(ph5.5)中，加入京尼平使其濃度為0.25％–2％，于室溫下交聯1–3d，用蒸餾水反復清洗。

4、茶多酚(tp)交聯：將膠原蛋白海綿浸入含0.25％–2％的tp水溶液中，于室溫下交聯1–3d，用蒸餾水反復清洗。

5、去甲二氫愈創木二酸(ndga)交聯：將膠原蛋白海綿浸入0.1m磷酸鹽緩沖液(ph7.0)30min，將ndga加入到1ml0.1mnaoh及9ml磷酸鹽緩沖液中配制成濃度為1–5mg/ml的ndga溶液，再將膠原蛋白海綿浸泡于上述ndga溶液中，交聯1–3d，用蒸餾水沖洗，后用70％乙醇浸泡，再用磷酸鹽緩沖液浸泡，最后用蒸餾水反復清洗。

6、疊氮二苯基磷(dppa)交聯：將膠原蛋白海綿浸入含0.25％–2％dppa的二甲基甲酰胺(dmf)溶液中，交聯1–3d，用硼酸鹽緩沖液(0.04m硼砂、0.04m硼酸，ph8.9)清洗過夜，再用70％乙醇清洗，最后用蒸餾水反復清洗。

(4)外層殼聚糖膜的制備：將殼聚糖配制成質量分數為10％的醋酸溶液，真空脫泡，倒入六孔板模具中，厚度為2mm，于50℃真空干燥箱中烘干成膜。

(5)內、外層點膠復合：在上述外層殼聚糖膜的一側涂布聚丙烯酸酯類生物膠，使內層膠原蛋白海綿和外層殼聚糖膜進行復合。

(6)復合多層敷料的制備：復合敷料的基布層為醫用無紡布，將無紡布的一側涂布醫用壓敏熱熔膠，使復合敷料的內外層與基布層復合。

(7)包裝、滅菌：交聯膠原蛋白復合多層醫用敷料包裝后經co-60滅菌。

實施例2

水生生物源交聯膠原蛋白復合多層醫用敷料的制備方法，步驟如下：

(1)高純度高活性醫用膠原蛋白的制備：鱈魚皮用刀片刮去魚鱗、殘肉和脂肪，冷水洗凈，用切片機切成0.5–1cm²的小塊。魚皮經超高壓處理以提高膠原蛋白的提取率，壓力為150mpa，處理時間為10min。將魚皮浸泡于1％的tritonx-100的磷酸緩沖液中，置于振蕩器上震蕩48h，120rpm，4℃，在蒸餾水中震蕩漂洗，再將魚皮浸泡于1％的sds磷酸緩沖液中，置于振蕩器上震蕩48h，120rpm，4℃，在蒸餾水中震蕩漂洗，重復上述步驟3次以脫除組織中的細胞。加入0.1mnaoh溶液(1:20,w/v)浸泡24h除去非膠原成分及色素，蒸餾水反復洗至中性。加入10倍體積10％正丁醇溶液攪拌48h，以去除脂肪，蒸餾水反復洗滌。使用組織搗碎機充分攪碎后，加入含0.5％(w/w)胃蛋白酶的0.5m醋酸(1:60,w/v)提取48h，離心(12,000rpm,30min，4℃)，所得上清液為膠原蛋白粗提液，再經研細的nacl鹽析，至溶液中nacl最終濃度為0.9m，靜置一夜，9,000rpm離心30min,收集沉淀溶于0.5m醋酸中，經二次鹽析后的膠原蛋白復溶于0.5m醋酸中，溶液對0.02m的磷酸氫二鈉溶液透析至ph≥8進行滅酶，再對蒸餾水透析除鹽，直至透析外液用硝酸銀溶液檢測無氯離子即為透析終點。透析后的膠原蛋白溶液用0.45μm的板式膜進行除菌，最后經2％(w/v)的藥用活性炭脫色和除熱源，離心后去除活性炭獲得高純度高活性的醫用膠原蛋白，低溫真空冷凍干燥。

(2)內層多孔膠原蛋白海綿的制備：將上述高純度高活性醫用膠原蛋白溶于0.5m的醋酸溶液中，按質量百分比，配制成濃度為0.8％的膠原蛋白溶液，磁力攪拌器攪拌至完全溶解，采用真空脫泡和低溫低速離心(5,000rpm,8min，4℃)并用的脫泡方式脫泡，倒入六孔板模具中，厚度為3mm，低溫預冷凍24h，冷凍干燥36h。

(3)內層膠原蛋白海綿交聯改性：將膠原蛋白海綿浸泡于ph為5.5的含50mm2-n-嗎啉已烷磺酸(mes)的40％乙醇中60min，再將其浸泡在含50mmmes、100mmedc、40mmnhs的40％乙醇(ph5.5)中，室溫下交聯4h，用0.1mna2hpo4清洗，再分別用1m、2m、4mnacl溶液清洗，最后用蒸餾水反復清洗。低溫預冷凍24h，冷凍干燥36h。

(4)外層殼聚糖膜的制備：將殼聚糖配制成質量分數為5％的醋酸溶液，真空脫泡，倒入六孔板模具中，厚度為2mm，于50℃真空干燥箱中烘干成膜。

(5)內、外層點膠復合：在上述外層殼聚糖膜的一側涂布聚丙烯酸酯類生物膠，使內層膠原蛋白海綿和外層殼聚糖膜進行復合。

(6)復合多層敷料的制備：復合敷料的基布層為醫用無紡布，將無紡布的一側涂布醫用壓敏熱熔膠，使復合敷料的內外層與基布層復合。

(7)包裝、滅菌：交聯膠原蛋白復合多層醫用敷料包裝后經co-60滅菌。

本發明通過控制膠原蛋白的提取純化工藝，得到了高純度高活性的醫用膠原蛋白。sds-page圖譜(圖1)顯示實施例中制備的膠原蛋白的α鏈組成為(α1)2α2，傅里葉紅外光譜圖(圖2)顯示其具有膠原蛋白的各伸縮振動峰，圓二色譜圖(圖3)表明其在221nm處有一正吸收峰，在196nm處有一負吸收峰，可判定提取的膠原蛋白為具有完整三螺旋結構的i型膠原蛋白。

內層膠原蛋白海綿色澤潔白，具有孔隙均勻的網絡狀結構，孔隙率≥98％，有利于組織滲出液的吸收(圖4)。

同時，本發明對未改性和改性的膠原蛋白海綿的特性進行了分析。

試驗和測試部分：

抗張強度的測定：參照gb/t1040.3-2006，將膠原蛋白海綿裁成適合的大小，兩端固定在質構儀上，設置參數如下：速度為60mm/min；標距為10mm；力量為300n。抗張強度ts＝f/s×1000，其中f為樣品斷裂時承受的最大張力(n)；s為樣品的橫截面積(mm²)。

液體吸收性的測定：參照yy/t0471.1-2004，將已知質量(wd)的膠原蛋白海綿樣品浸潤在預熱至37℃的試驗液中，并在37℃水浴中孵育5h，用鈍頭鑷子夾持樣品一端，懸垂30s后稱重(ww)，液體吸收量＝(ww-wd)/wd。其中，試驗液為由氯化鈉和氯化鈣的溶液組成，該溶液含142mmna⁺和2.5mmca²⁺。根據en13726-1，該溶液的離子含量相當于人體血清或創面滲出液。

酶降解性的測定：將膠原蛋白海綿裁成適當大小，精確稱重，浸潤在1ml含50mmcacl2的tris-hcl溶液(0.1m,ph7.4)中，在37℃水浴1h，然后添加200u細菌膠原酶，溶解于1ml的0.1mtris-hcl溶液中，37℃孵育24h。通過添加0.2ml的0.25medta溶液并在冰中迅速冷卻來結束酶的消化。隨后，混合物在5000rpm、4℃下離心15min，上清液用于測定羥脯氨酸含量。

實驗結果：

對膠原蛋白海綿進行改性處理，機械強度、液體吸收性和抗酶降解能力均顯著提高，具體數據如表1所示。

表1改性對膠原蛋白海綿機械性能、液體吸收性和抗酶降解能力的影響

采用本發明制備的醫用級魚皮膠原蛋白，可充分有效的去除魚皮的非膠原成分，獲得高活性高純度的膠原蛋白，提高了魚類下腳料的綜合利用率，實現了水產品資源的高值化利用，并且溶血率為1％–3％，具有良好的生物相容性。

同時，制備的復合多層醫用敷料兼具了內層膠原蛋白多孔海綿的止血、促進傷口愈合、吸收組織滲出液、促進細胞生長的功效和外層殼聚糖膜的抵御細菌侵入、保持傷口的濕潤環境等功效以及無紡布基布層的固定和支撐作用，是一種新型的高性能的醫用敷料，解決了單一膠原蛋白敷料機械強度差、抗降解能力弱、傷口易受微生物感染、易引起炎癥反應等一系列問題。

上述實施例僅是為了更清楚地說明而作的舉例，并非是對實施方式的限定。對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的情況下還可以在上述基礎上做出變化或替換，仍處于本發明創造的保護范圍之內。