漢黃芩素在制備治療結腸癌藥物中的應用的制作方法

技術領域：

本發明涉及含有雜環化合物的醫藥配制品，具體涉及來自唇形科植物黃酮類化合物的抗腫瘤藥物制劑。

背景技術：
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結腸癌是我國九大常見惡性腫瘤之一。近年來在我國結腸癌發病率呈上升趨勢。據中國癌癥統計，估計2015年將會有2814000名中國人死于癌癥。男性和女性死亡率最高的癌癥均為：肺和支氣管癌、胃癌、肝癌、食道癌、結直腸癌，占到了所有癌癥死亡的四分之三。因結腸癌死亡者，男性居惡性腫瘤死亡的第5位，女性居第6位。因此，尋求新的有效的結腸癌治療藥物，提高臨床療效，是當前迫切需要研究的問題。隨著我國中醫藥的發展，從中草藥中尋求具有高效、低毒、穩定等特點的抗腫瘤藥物是非常適宜的手段之一。

漢黃芩素(wogonin)是傳統中草藥黃芩的活性成分之一,其化學結構如下式(ⅰ)所示，目前已從黃芩中發現41種黃酮類化合物,其中含量較高且具有明顯藥理作用的主要是黃芩苷(baicalin)、黃芩苷元(baicalein)、漢黃芩素(wogonin)、漢黃芩苷(wogonoside)和千層紙素(oroxylina)等。近年來,國內外研究人員從不同方面對漢黃芩素的抗癌作用及作用機制進行了深入的研究,發現漢黃芩素對腫瘤細胞的殺傷作用有其獨特的機制。

漢黃芩素是唇形科植物黃芩及同屬多種植物的根中所含的黃酮類化合物，其化學名稱為5,7-二羥基-8-甲氧基-2-苯基-4h-1-苯并呋喃-4-酮，分子式為c16h12o5，分子量為284.26。漢黃芩素是一種溶于有機溶劑而不溶于水的黃色針狀結晶物，現有研究表明漢黃芩素有多種藥理作用，包括抗氧化作用，抗凝血作用，解痙作用，此外還要抗菌、抗病毒作用以及利尿作用等。但是，目前尚未見有類似發明所述的提取物對結腸癌作用的報道。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供漢黃芩素的新用途，即在制藥中的新用途。

上述漢黃芩素的新用途是，漢黃芩素在制備治療結腸癌藥物中的應用，其中所述的漢黃芩素的化學結構式如下式(ⅰ)所示，

上述應用中，所述的藥物由漢黃芩素和醫學上可接受的輔料組成。

上述應用中，所述的藥物為納米乳注射劑、膠囊劑或片劑。

本發明所述應用中的漢黃芩素治療結腸癌的效果顯著，在體外對結腸癌細胞生長有很強的抑制作用，并能夠抑制結腸癌細胞hct116的自噬，促進細胞凋亡；在體內對化學誘導腫瘤模型的生長具有良好的抑制作用。

了便于公眾更好地理解，下面通過藥效實驗和具體實施方式來進一步說明本發明的有益效果。

附圖說明：

圖1為漢黃芩素對結腸癌細胞活力影響的條形圖。

圖2為漢黃芩素抑制結腸癌細胞hct116自噬的電泳圖。

圖3為漢黃芩素促進結腸癌細胞凋亡的電泳圖。

圖4為漢黃芩素抑制其腫瘤生長的效果圖，該圖為化學誘導結腸癌小鼠模型組及藥物處理組的結腸長度圖。

具體實施方式：

實驗例1：漢黃芩素對體外結腸癌細胞的抑制作用

取對數生長期的腫瘤細胞，以4000/孔接種于96孔板培養板中，培養過夜，細胞生長狀態良好后，棄去原有的培養基，然后按照設計的藥物濃度：漢黃芩素0,1,2,4,10,20,40,80μm作用于hct116細胞72h后停止培養，然后加入100μl/孔的mtt(0.5mg/ml)溶液，處理4h后，棄上清，最后加入150μl的dmso振蕩混勻，置于酶標儀中測定其吸光度值(測定波長為570nm)。結果如圖1所示，漢黃芩素可明顯抑制結腸癌細胞hct116的生長。

實驗例2：漢黃芩素抑制結腸癌細胞hct116的自噬

取對數生長期的hct116細胞以5×10⁴個/孔接種于6孔培養板中，過夜培養，待細胞貼壁狀態較好時，棄去培養基，加入含不同濃度漢黃芩素(0、5、10μm)的新鮮培養基繼續培養72h后，消化、收集細胞、離心、pbs洗滌2次，洗掉上清，然后加入適量ripa和1％的蛋白酶抑制劑pmsf，裂解細胞45min后，收集上清液并測定蛋白含量，使用westernblotting的方法檢測自噬相關蛋白的表達情況。結果如圖2所示，漢黃芩素作用于hct116細胞后可抑制其自噬相關蛋白的表達水平。

實驗例3：漢黃芩素可以促進結腸癌細胞凋亡

取對數生長期的hct116細胞以5×10⁴個/孔接種于6孔培養板中，過夜培養，待細胞貼壁狀態較好時，棄去培養基，加入含不同濃度漢黃芩素(0、5、10μm)的新鮮培養基繼續培養72h后，消化、收集細胞、離心、pbs洗滌2次，洗掉上清，然后加入適量ripa和1％的蛋白酶抑制劑pmsf，裂解細胞45min后，收集上清液并測定蛋白含量，使用westernblotting的方法檢測凋亡相關蛋白的表達情況。結果如圖3所示，漢黃芩素作用于hct116細胞后可促進其凋亡相關蛋白的表達水平。

實驗例4：漢黃芩素對化學誘導的腫瘤模型有抑制其腫瘤生長的作用

建立化學誘導結腸癌的動物模型。選用4到6周齡的雌性c57bl/6小鼠，將小鼠隨機分成4組，每組20只，分別為：1.空白對照組；2.漢黃芩素劑量給藥組(50mg/kg)；3.漢黃芩素劑量給藥組(100mg/kg)；4.模型組。除了空白對照組另3組于第5周腹腔注射aom一次，第2、3、4組于第6、9、12周在其飲用水里加入2％的dss，dss溶液給藥一周，三天換一次，每次更換新鮮配置，給藥組從第5周開始每周固定時間灌胃給藥1次(50、100mg/kg)，期間每3天稱量小鼠體重1次，監測飲水量、進食量，監測糞便指數，仍按照dai評分評價小鼠糞便，觀察dss損傷后的修復狀態至第25周給藥結束后，處死小鼠，取小腸、心、肝、脾、肺、腎、胸腺等組織并保存。結果如圖4所示，漢黃芩素能抑制結腸癌的生長，給藥組的小鼠結腸段較模型組更長，炎癥更輕，具有體內抗腫瘤有活性。

實驗例5：藥物制劑的制備例

例1(納米乳注射劑劑)

取漢黃芩素25mg，以吐溫-80：中鏈甘油三酯(mct)：正丁醇的質量比為4:1：0.9稱取總質量為35mg，50℃水浴加熱溶解，得均勻透明的溶液。在磁力攪拌條件下下，將常溫注射用水100ml加入該溶液，乳化30min，形成淡黃色、澄清透明的漢黃芩素納米乳。于潔凈環境下，0.22μm微孔濾膜過濾，將濾液灌封在已滅菌的2ml、5ml安瓿中，拉封。將灌封好的漢黃芩素納米乳注射劑121℃、0.1mpa熱壓滅菌15min，即得。

例2(自微乳腸溶硬膠囊劑)

①封口液的配制。將骨明膠溶于60℃的水中.另將羧甲基纖維素鈉分散于乙醇中，再將二者在攪拌下混合，保持溫度約為50℃，備用。

②制劑的制備。將24mg漢黃芩素與吐溫-8018mg及peg-4006mg混合后再與大豆油10mg混合，邊攪拌邊將藥液灌裝于腸溶空心硬膠囊中.用已配好的封口液對膠囊鎖口處進行封口.室溫下晾干即得。

例3(片劑)

取漢黃芩素40g，加入乳糖480g、淀粉1100g混合均勻，用7％的淀粉漿300g作為粘合劑濕法制粒，烘干，加入硬脂酸鎂16g混合，壓制成每片含漢黃芩素4mg的片劑10000片，每片凈重0.17g。