本發明公開了救必應酸的新用途，具體為救必應酸在制備抗流感病毒藥物中的應用。
背景技術：
流行性感冒病毒(簡稱流感病毒)可引起急性呼吸道感染，會對人類的健康造成威脅。其中，甲型流感病毒由于抗原性易發生變異，由其引發的甲型h1n1流感具有流行面廣、傳染性強、發病率高等特點。目前，應對流感病毒主要是通過疫苗和藥物治療。其中，m2離子通道抑制劑金剛烷胺類以及神經氨酸酶抑制劑是許多國家在臨床上常用的抗流感病毒藥物，但是這兩類抗病毒藥物現在均出現不同程度的耐藥性，且有一定的毒副作用。因此，尋找新的、高效低毒的抗流感病毒藥物顯得十分重要和緊迫。
救必應酸(分子式為c30h48o5)，可提取自冬青科冬青屬植物鐵冬青ilexrotundathunb.的干燥樹皮，其原料中藥救必應來源豐富，低廉，顯示出救必應酸良好的藥物應用前景。
救必應酸屬五環三萜化合物，具有五環三萜母核。五環三萜類化合物的結構通式為：
式中，r為cooh、coo―β―d―葡萄糖基或其他藥學上可接受的基團。當式中的r為cooh時，化合物名為救必應酸(rotundicacid)。
目前，專利文獻cn101856357a公開了救必應酸具有防治心腦血管疾病，包括心絞痛、心肌梗死、腦梗死的作用。專利文獻cn102391352a公開了救必應酸的氨基酸衍生物具有體外抗腫瘤活性。但尚未見關于救必應酸抗流感病毒作用的研究報道。
技術實現要素：
本發明目的在于公開救必應酸的新藥用用途，具體涉及救必應酸在制備抗流感病毒藥物中的應用。包括h1n1流感病毒。
并進一步公開，救必應酸在制備治療由流感病毒引起的肺炎藥物中的應用。
與現有技術相比，本發明首次公開救必應酸在制備抗流感病毒藥物中的新用途。經體外細胞實驗，證明救必應酸抗h1n1流感病毒的ic50值為5.8μg/ml，與陽性藥利巴韋林作用相當。小鼠流感模型藥理實驗證實，救必應酸可顯著降低流感感染小鼠的肺指數，并且對h1n1呈現一定的量效特征。
具體實施方式
為更好理解本發明內容，下面結合具體實施例對本發明的內容作進一步說明，但本發明的保護內容不局限于以下實施例。
實施例1救必應藥材提取物的制備
取救必應藥材適量，粉碎，過1號篩，藥材加8倍量70％(體積分數)乙醇，加熱回流提取2次，每次1h，過濾，合并提取液，置旋轉蒸發器中，在80℃下減壓濃縮至稠膏狀。將濃縮液轉移置減壓干燥箱中，在80℃下繼續進行干燥、粉碎，即得救必應藥材提取物。
實施例2體外流感病毒抑制實驗
1.實驗材料
1.1受試藥物：救必應酸(從救必應中提取得到，純度＞98％)。
1.2對照藥物：利巴韋林，齊墩果酸，救必應藥材提取物(見實施例1)
1.3病毒株：甲型h1n1流感病毒鼠肺適應株(fm/1/47株)。雞胚傳代，bsl-3(生物安全實驗室三級)實驗室內檢測，分裝，-80℃保存。
1.4細胞模型：狗腎細胞mdck細胞
上述藥物均經二甲基亞砜(dmso)充分溶解后-20℃保存備用。
2.實驗方法
2.1病毒毒力的測定
將mdck細胞按5×104/ml濃度接種96孔培養板，每孔100μl，37℃、5％co2培養，形成細胞單層鋪滿狀態。將100μl10倍系列稀釋得到的6個濃度的病毒液，依次接種到長滿單層mdck細胞層的96孔板中，同時設細胞對照。37℃、5％co2病毒培養箱中培養，逐日用倒置顯微鏡觀察細胞病變(cpe)，連續觀察3天，用mtt法進行檢測,在酶標儀570nm波長測定吸光度od值，用reed-muench法計算病毒半數感染劑量(tcid50)，每濃度設8個復孔，整個實驗重復3次，取平均值。
測定結果：mdck細胞受到流感病毒攻擊后，細胞會發生凋亡，在細胞形態學上主要表現為細胞圓縮，核固縮，碎裂等，在細胞周圍形成典型的圓形凋小體。用reed-muench法計算結果得：病毒毒力tcid50為10-4.5。
2.2救必應酸細胞毒性測定
取mdck細胞已長成單層的96孔細胞培養板，傾去培養液，用pbs洗滌2次，加入不含血清的dmem培養基連續2倍系列稀釋(488μg/ml-3.81μg/ml)的救必應酸藥液，100μl/孔，每個濃度設4個復孔，設正常細胞對照4孔。37℃、5％co2病毒培養箱中培養72h，用mtt法進行檢測，在570nm波長下測出各實驗組與細胞對照組的吸收度。以對照孔為參照，計算各實驗孔細胞的活力比值。根據reed-muench法計算細胞毒性濃度cc50，整個實驗重復3次，取平均值。
測定結果：救必應酸的細胞半數毒性濃度cc50>488μg/ml。
2.3救必應酸抗h1n1活性測試
取mdck細胞已長成單層的96孔細胞培養板，傾去培養液，用pbs洗滌2次，加入100tcid50病毒液，100μl/孔，37℃、5％co2吸附2h。加入不含血清的dmem培養基連續2倍系列稀釋(244μg/ml-3.81μg/ml)的救必應酸藥液,同時設病毒對照組、細胞對照組、陽性藥組、救必應藥材提取物組和齊墩果酸組。在37℃、5％co2培養箱中培養72h后，用mtt法進行檢測，用酶標儀測570nm波長處的吸光度od值。按下述公式計算藥物對病毒的抑制率：病毒抑制率(％)＝(藥物處理組od均值-病毒對照組od均值)/(細胞對照組od均值-病毒對照組od均值)×100％，根據reed-muench法計算藥物對流感病毒致cpe產生50％抑制的濃度，即半數抑制濃度ic50，整個實驗重復3次，取平均值。
實驗結果：根據mtt結果，采用reed-muench法計算救必應酸的半數抑制濃度ic50為5.8μg/ml，齊墩果酸的半數抑制濃度ic50為37.5μg/ml，救必應藥材提取物的半數抑制濃度ic50>244μg/ml。陽性藥物利巴韋林的半數抑制濃度ic50為6.8μg/ml。
結論：救必應酸在對h1n1流感病毒具有較強的抑制作用，其ic50值與利巴韋林ic50值大小接近，且比齊墩果酸以及救必應藥材提取物ic50值都要小，證明救必應酸對h1n1流感病毒的抑制作用與陽性對照藥物利巴韋林相當，且強于齊墩果酸和救必應藥材提取物。
實施例3體內流感抑制實驗
1.實驗材料
1.1受試藥物：救必應酸(從救必應中提取得到，純度＞98％)。
1.2對照藥物：達菲，齊墩果酸，救必應藥材提取物(見實施例1)
1.3病毒：甲型h1n1流感病毒鼠肺適應株(fm/1/47株)。雞胚傳代，bsl-3(生物安全實驗室三級)實驗室內檢測，分裝，-80℃保存。
2.實驗動物
balb/c小鼠體重18g-22g，80只，購自廣東省實驗動物中心。
3.實驗方法
將balb/c小鼠隨機分為8組，分別為空白對照組、模型對照組、達菲對照組、齊墩果酸組、救必應藥材提取物組、救必應酸高、中、低3個劑量組，每組10只。除空白對照組外，各實驗組動物用乙醚輕度麻醉，以15個ld50的fm1流感病毒液滴鼻感染，每只35μl。感染前一天開始灌胃給藥，每次按0.2ml/10g體重灌胃，每天1次，連續給藥5天。空白組和模型對照組在同等條件下灌胃給予等體積蒸餾水。第6天稱重后解剖，取肺，稱重量，計算肺指數與肺指數抑制率。
計算公式：肺指數＝肺質量(g)/體重(g)×100％；肺指數抑制率＝(模型對照組平均肺指數－實驗組平均肺指數)/模型對照組平均肺指數×100％數據處理與統計方法：肺指數用平均值±sd值表示，組間比較采用單因素方差分析；采用spss19.0軟件處理數據。
4.實驗結論
肺指數值越大，表示肺炎越嚴重。由表1的實驗結果顯示，本發明的救必應酸能夠顯著降低流感感染小鼠的肺指數，且對h1n1呈現一定的量效特征，表明救必應酸對流感病毒具有防治作用。此外，救必應酸對于流感病毒的防治效果明顯強于齊墩果酸與救必應藥材提取物。本發明所述的救必應酸可作為活性成分制備用于抗流感病毒的藥物。
表1藥物對流感病毒fm/1/47株感染小鼠肺炎模型肺指數的影響(n＝10)
注：##與空白對照組比較，p<0.05，**與模型對照組比較，p<0.01。