去細胞角膜基質透鏡在治療眼科疾病中的應用的制作方法

本發明涉及組織工程學技術領域，尤其是涉及一種去細胞角膜基質透鏡在治療眼科疾病中的應用。

背景技術：

遠視是平行光線進入眼內后在視網膜之后的一種屈光狀態，當眼球的屈光力不足或其眼軸長度不足時就產生遠視。遠視作為眼科疾病的一種，極大的影響了人們的生活質量，尤其是隨著年齡的增大，遠視的發生幾率也會升高。

遠視是臨床常見的屈光不正眼病，高度遠視的矯正一直是屈光治療的難題。目前遠視矯正治療的方法主要包括框架眼鏡、角膜接觸鏡或者屈光手術。

老視是一種生理現象，不是病理狀態也不屬于屈光不正，是人們步入中老年后必然出現的視覺問題。隨著年齡的增長，出現老視的患者必須增加凸透鏡才能獲得清晰的近視力。

目前，植入式的角膜接觸鏡多采用合成材料制成，可以根據不同患者的屈光狀態生產出各種度數和型號大小的透鏡，術后視力恢復快，但其弊端也比較明顯，比如：術后可能出現散光增加，早期可能出現角膜霧狀渾濁；而且其適用癥有限，并存在角膜瓣相關風險，在長期植入過程中可能出現角膜損傷，視覺質量下降的情況；另外，其安全性較低，屬于永久性異物，在長期植入過程中可能出現免疫排斥反應。因此，對于高度遠視、老視及合并屈光參差的患者，需要找到適應癥更廣、安全性更高、預測性更強、穩定性更佳的透鏡材料。

對于角膜基質移植所需的材料而言，不僅要求有良好的光學特性，還要求與人眼組織有良好的組織相容性，人工合成材料在生物組織相容性上有很大的弊端，而利用動物源性的角膜，則能夠在很大程度上緩解人工合成材料的組織相容性差的問題。

但使用動物源性角膜也存在著一些問題，例如：(1)雖然動物源性角膜的組織相容性較好，但如果其自身細胞去除不完全，則會存在產生免疫排斥反應的風險；(2)此外，雖然目前已有一些去除角膜基質細胞的方法，但是現有的角膜去細胞基質制備工藝容易導致角膜吸水腫脹，導致基質中的膠原纖維排列或構象發生改變，使角膜基質透明度下降，引起原始形態、曲率等發生改變；(3)而且，傳統的角膜透鏡通常是以特殊的角膜刀切削制得，工藝相對粗糙，可能造成削切面不夠光滑，或者透鏡部分丟失，預測性和安全性較差，且術后近期并發癥，如散光等發生率較高。

由此可見，豐富眼科疾病的治療方法，提供新的治療材料，對于臨床應用，具有重要的意義。

有鑒于此，特提出本發明。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供去細胞角膜基質透鏡在治療眼科疾病中的應用，以彌補現有技術中的不足，緩解現有技術中存在的眼科疾病治療方法欠缺的問題。

本發明提供了去細胞角膜基質透鏡在治療眼科疾病中的應用，所述去細胞角膜基質透鏡的制備方法包括：將帶有細胞的角膜基質透鏡依次進行細胞裂解和交聯處理，然后經過滅菌得到所述去細胞角膜基質透鏡。

進一步的，所述眼科疾病為遠視、屈光參差或者老視。

進一步的，所述細胞裂解的方法包括：用含有0.1％-3％tritonx-100的0.9％生理鹽水或磷酸鹽緩沖液浸泡12-48h，然后用0.9％的生理鹽水漂洗48-96h。

進一步的，所述交聯的方法包括：用含有交聯劑的0.9％生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中浸泡，然后用0.9％生理鹽水或者磷酸鹽緩沖溶液漂洗24-96h，所述交聯劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、n-羥基硫代琥珀酰亞胺、京尼平或者戊二醛。

進一步的，所述交聯劑的使用量與角膜基質透鏡的質量比為1:1-1:15。

進一步的，在所述細胞裂解處理之前，還包括消毒處理，所述消毒的方法包括：用含有濃度為0.01～0.1mg/ml青霉素和濃度為0.05～0.5mg/ml鏈霉素的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液浸泡1-5h，然后用0.9％的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液漂洗。

進一步的，在所述交聯處理之后，還包括滅菌處理，所述滅菌的方法包括：用γ射線進行輻照，輻照劑量為20～30kgy。

進一步的，所述帶有細胞的角膜基質透鏡是通過全飛秒激光技術獲得的。

進一步的，所述制備方法包括：

步驟(a)，消毒：將通過全飛秒激光技術獲得帶有細胞的準確厚度的角膜基質透鏡，用含有濃度為0.01～0.1mg/ml青霉素和濃度為0.05～0.5mg/ml鏈霉素的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液浸泡1-5h，然后用0.9％生理鹽水或磷酸鹽緩沖液漂洗；

步驟(b)，細胞裂解：用含有0.1％-3％tritonx-100的0.9％生理鹽水或磷酸鹽緩沖液浸泡12-48h，然后用0.9％生理鹽水或磷酸鹽緩沖液漂洗48-96h；

步驟(c)，交聯：用含有交聯劑的0.9％生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中浸泡，然后用0.9％生理鹽水或者磷酸鹽緩沖溶液漂洗24-96h，所述交聯劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，或n-羥基硫代琥珀酰亞胺；所述交聯劑的使用量與所述經過細胞裂解處理的角膜基質透鏡的質量比為1:1-1:15；

步驟(d)，滅菌：用γ射線進行輻照，輻照劑量為20～30kgy。

按照本發明的方法制得的去細胞角膜基質透鏡，不僅能夠有效去除基質中細胞成分降低基質的免疫原性，提高角膜的力學強度；更能有效保持角膜基質的原始形態和透明度，所制得的去細胞角膜基質透鏡具有安全性更高、透明度更佳和性能更穩定的特點。因此，可作為永久性植入透鏡，用于治療眼科疾病，為臨床上高度遠視及屈光參差的矯正提供新的治療方法。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1去細胞角膜基質透鏡的he染色結果圖；

圖2為去細胞并進行交聯后的角膜基質透鏡的he染色結果圖；

圖3為帶細胞角膜基質透鏡和去細胞角膜基質透鏡的透光率比較圖；

圖4為去細胞角膜基質透鏡的細胞毒性試驗結果圖；

圖5a為角膜基質透鏡的顯微圖(低倍)；

圖5b為角膜基質透鏡的顯微圖(高倍)；

圖6為角膜基質透鏡植入新西蘭白兔角膜基質的手術示意圖；

圖7a為新西蘭白兔手術前角膜的顯微圖；

圖7b為新西蘭白兔手術后角膜的顯微圖；

圖8為新西蘭白兔手術前后的角膜厚度變化圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明提供了去細胞角膜基質透鏡在治療眼科疾病中的應用，其中，去細胞角膜基質透鏡的制備方法包括：將帶有細胞的準確厚度的角膜基質透鏡依次進行細胞裂解和交聯處理，然后經過滅菌后得到去細胞角膜基質透鏡。

在一種優選的實施方式中，眼科疾病為遠視。

在一種優選的實施方式中，眼科疾病為屈光參差。

在一種優選的實施方式中，眼科疾病為遠視。

在去細胞角膜基質透鏡的制備方法中：

其中，細胞裂解的方法中涉及的0.1％-3％tritonx-100，例如可以為，但不限于0.1％tritonx-100、0.3％tritonx-100、0.5％tritonx-100、0.8％tritonx-100、1％tritonx-100、1.5％tritonx-100、2％tritonx-100、2.5％tritonx-100或者3％tritonx-100。

其中，交聯的方法中涉及的交聯劑例如可以為，但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺，或者n-羥基硫代琥珀酰亞胺，或者京尼平，或者戊二醛。

其中，交聯的方法中涉及的交聯劑的使用量與角膜基質透鏡的質量比為1:1-1:15，其質量比例如可以為，但不限于1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或者1:15。

其中，消毒的方法中涉及的濃度為0.01～0.1mg/ml青霉素和濃度為0.05～0.5mg/ml鏈霉素的生理鹽水，其中青霉素例如可以為，但不限于0.01mg/ml、0.03mg/ml、0.05mg/ml、0.07mg/ml、0.1mg/ml；其中鏈霉素例如可以為，但不限于0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml。

其中，滅菌的方法中涉及的輻射劑量為20～30kgy，例如可以為，但不限于20kgy、21kgy、22kgy、23kgy、24kgy、25kgy、26kgy、27kgy、28kgy、29kgy或30kgy。

其中，帶有細胞的角膜基質透鏡來自于人或者其他動物(其他動物例如可以為，但不限于豬、牛或者羊等)，優選的，帶有細胞的角膜基質透鏡來自于人。

其中，涉及的全飛秒激光技術，是指利用全飛秒激光小切口角膜基質透鏡取出術(smallincisionlenticuleextraction,smile)進行切取的技術。smile是應用超短脈沖激光在角膜內完成兩次脈沖掃描，制作角膜基質內鏡片后將其取出，可以降低對角膜神經的損傷及生物與力學的影響。

另外，本發明中涉及的帶有細胞的角膜基質透鏡是指未經處理的、直接從人或者其他動物眼內取出的新鮮的角膜基質透鏡。

為了有助于更清楚的理解本發明，現通過具體的實施例對本發明的內容進行詳細的介紹。如未明確指出，以下實施例中涉及的實驗操作方法為常用的分子生物學或醫學操作方法，涉及的試劑、儀器為常規的市售試劑或者儀器。

實施例1去細胞角膜基質透鏡的制備方法

步驟(a)，消毒：將通過全飛秒激光技術獲得帶有細胞的準確厚度的角膜基質透鏡，用含有濃度為0.01mg/ml青霉素和濃度為0.1mg/ml鏈霉素的生理鹽水浸泡3h，然后用0.9％生理鹽水漂洗；

步驟(b)，細胞裂解：用含有0.5％tritonx-100的0.9％生理鹽水浸泡24h，然后用0.9％生理鹽水漂洗96h；

步驟(c)，交聯：用含有交聯劑的0.9％的生理鹽水中浸泡，然后用0.9％生理鹽水漂洗24h，交聯劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)；交聯劑的使用量與經過細胞裂解處理的角膜基質透鏡的質量比為1:5；

步驟(d)，滅菌：將交聯后的角膜透鏡用γ射線進行輻照，輻照劑量為25kgy；

需要說明的是，在本實施例1中，帶有細胞的角膜基質透鏡來自于人。

另外，發明人對按照實施例1的方法制備得到的去細胞角膜基質透鏡的性能進行了分析，具體實驗如下。

he染色實驗

分別對帶有細胞的角膜基質透鏡、按照實施例1的方法制備得到的去細胞角膜基質透鏡進行he染色，結果分別如圖1和圖2所示，脫細胞后的角膜基質透鏡的he染色圖(圖1)中可以看到基本沒有細胞殘留，但基質纖維間存在一些空隙；而按照實施例1的方法進行交聯后得到的去細胞角膜基質透鏡he染色圖(圖2)中則基本看不到空隙，說明本發明提供的方法可以有效除去角膜基質透鏡中的細胞，并保持角膜基質透鏡形態學穩定。

透光率檢測實驗

利用分光光度計在可見光波段(390nm-780nm)分別對帶有細胞的角膜基質透鏡、按照實施例1的方法制備得到的去細胞角膜基質透鏡進行透光率分析，結果如圖3所示，按照實施例1的方法制備得到的去細胞角膜基質透鏡的可見光透光率基本與新鮮角膜基質(即帶有細胞的角膜基質透鏡)一致，說明該工藝對角膜基質透鏡的透光性能影響較小，能使之保持較好的透光率。

其中，圖3中，去細胞角膜基質即為去細胞角膜基質透鏡；新鮮角膜基質即為帶有細胞的角膜基質透鏡。

細胞毒性試驗

參考國家標準gb/t_16886.5-2003，對去細胞后的角膜透鏡進行細胞毒性評價，結果如圖4所示。由圖4可以看出，與去細胞角膜基質透鏡共培養的細胞正常生長，說明該去細胞角膜基質透鏡具有良好的生物相容性。

角膜形態觀察

在顯微鏡下對角膜透鏡進行形貌觀察，結果如圖5a和5b所示。由圖5a和5b可以看出，利用飛秒激光技術切割得到的角膜基質透鏡邊緣未見缺損，形態完整。

動物實驗

以健康新西蘭白兔研究載體，將按照實施例1的方法得到的去細胞角膜基質透鏡，植入新西蘭白兔角膜基質層間囊袋，以裂隙燈顯微鏡進行角膜形態學功能學檢測，過程見圖6，結果如圖7a、圖7b和圖8所示。由圖7a、圖7b和圖8可以看出，該去細胞角膜基質透鏡在體內厚度變化基本保持不變，能保持原來的狀態，滿足角膜生物力學性能的要求，可以為角膜基質透鏡移植矯正遠視的臨床應用提供基礎依據。

實施例2去細胞角膜基質透鏡的制備方法

步驟(a)，消毒：將通過全飛秒激光技術獲得帶有細胞的準確厚度的角膜基質透鏡，用含有濃度為0.05mg/ml青霉素和濃度為0.2mg/ml鏈霉素的生理鹽水浸泡2h，，然后用0.9％生理鹽水漂洗；

步驟(b)，細胞裂解：用含有0.3％tritonx-100的0.9％生理鹽水浸泡48h，然后用0.9％的生理鹽水漂洗96h；

步驟(c)，交聯：用含有交聯劑的0.9％生理鹽水中浸泡，然后用0.9％生理鹽水漂洗24h，交聯劑n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs)；交聯劑的使用量與經過細胞裂解處理的角膜基質透鏡的質量比為1:9；

步驟(d)，滅菌：將交聯后的角膜透鏡用γ射線進行輻照，輻照劑量為25kgy；

需要說明的是，在本實施例2中，帶有細胞的角膜基質透鏡來自于人。

實施例3去細胞角膜基質透鏡的制備方法

步驟(a)，消毒：將新鮮的帶有細胞的角膜基質透鏡，用含有濃度為0.1mg/ml青霉素和濃度為0.5mg/ml鏈霉素的生理鹽水浸泡1h，，然后用0.9％生理鹽水漂洗；

步驟(b)，細胞裂解：用含有0.4％tritonx-100的0.9％生理鹽水浸泡36h，然后用0.9％生理鹽水漂洗72h；

步驟(c)，交聯：用含有交聯劑的0.9％的生理鹽水中浸泡，然后用0.9％生理鹽水漂洗24h，交聯劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺；交聯劑的使用量與經過細胞裂解處理的角膜基質透鏡的質量比為1:10；

步驟(d)，滅菌：將交聯后的角膜透鏡用γ射線進行輻照，輻照劑量為25kgy；

需要說明的是，在本實施例3中，帶有細胞的角膜基質透鏡來自于人。

按照本發明涉及的去細胞角膜基質透鏡的制備方法，制得的去細胞角膜基質透鏡具有以下優點：

首先，在生理鹽水環境對角膜基質透鏡進行細胞裂解和交聯，避免角膜基質透鏡出現吸水/脫水狀態，改變膠原纖維的構象和排列，這樣能使角膜基質透鏡有效地保持原始形態、厚度和曲率。在這種狀態下對角膜基質透鏡中的細胞進行裂解和交聯，不僅能有效除去基質中細胞成分，降低基質的免疫原性，提高角膜的力學強度，更能有效保持角膜基質透鏡的原始形態和透明度，從而獲得安全性更高、透明度更佳和性能更穩定的角膜基質透鏡。

其次，角膜基質透鏡植入后可以作為角膜基質細胞生長增值的三維支架，角膜細胞可以在透鏡中遷移和生長，最終與自體角膜融為一體，可作為永久性植入透鏡，為臨床上高度遠視及屈光參差的矯正提供新的治療方法。以該透鏡作為植入式角膜接觸鏡可以避免出現合成材料類角膜透鏡的永久異物情況，避免免疫排斥等現象的出現。

另外，全飛秒激光技術可以精確切削，使得角膜透鏡的制備更加精密，可以避免傳統切削工藝造成的角膜透鏡丟失；而本申請則利用了全飛秒激光技術進行切削，制備工藝更精密，預測性更強。

按照本發明中涉及的方法，制備得到的去細胞角膜基質透鏡，具有安全性更高、透明度更佳和性能更穩定的特點。因此，能夠將其應用于治療多種眼科疾病，尤其是應用于治療遠視及老視。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。