一種使用構建的基因VII型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗的制作方法

本發明屬于疫苗病毒株構建技術領域，具體涉及一種使用構建的基因vii型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗。

技術背景

新城疫是由新城疫病毒引起的一種急性烈性傳染病，對養禽業的危害極大，曾經被國際獸疫局(oie)列為a類病。nd于1926年首先被發現于印度尼西亞爪哇，同年發現于英國的紐卡斯爾城，此后迅速向世界各地傳播。目前nd已在世界范圍內發生了四次大流行，并且宿主范圍不斷擴大。

劉秀梵等對1985‐2003年分離自江蘇浙江地區的29株新城疫病毒進行序列分析，結果顯示有17株屬于基因vii型，其中10株分離自發病鵝群。劉華雷等對2005年分離自中國大陸地區的83株新城疫病毒進行分析顯示，其中64株屬于基因vii型。lien等對2003‐2006年間分離自臺灣地區的20株新城疫病毒均為基因vii型。此外同階段中國周邊的韓國和日本流行的ndv也大都為基因vii型。我們對本實驗室近年分離的部分ndv毒株也進行了測序分析，結果顯示，70％以上的毒株為基因vii型。由此看出，基因vii型新城疫病毒在中國禽群中廣泛流行，是目前的絕對優勢基因型。

當前市場上對新城疫病毒的防控主要使用iv系疫苗株lasota、clone30和ii系疫苗株b1等基因ii型的毒株，它們雖然可以提供一定的免疫保護，但是不能完全阻止新城疫病毒的傳播、擴散，特別是基因vii型新城疫病毒的流行給養殖業造成了巨大的經濟損失。由于流行的基因vii型新城疫病毒都是強毒，因此大多數毒株不適合作為疫苗株使用，除非是自然弱毒株或是基因工程手段人工致弱的毒株。獲得弱毒株是生產疫苗的關鍵。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種使用構建的基因vii型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗，從而彌補現有技術的不足。

本發明所提供的疫苗，其中使用的抗原為vii型新城疫病毒弱毒株，其是將vii型新城疫病毒的p蛋白的237位和240位的氨基酸分別突變為蘇氨酸t和異亮氨酸i；同時將f蛋白也進行弱毒性突變構建的。

上述的vii型新城疫病毒弱毒株，其一種具體操作方法是通過反向遺傳操作方法來構建vii型新城疫病毒弱毒株，其包括如下的步驟：

構建表達t7rna聚合酶的細胞系、

所述的細胞系，是將表達t7rna聚合酶的基因與載體pci‐neo連接后轉染df1細胞獲得的；

提供基因vii型新城疫病毒ndv拯救過程中需要的輔助重組質粒和一個全基因組重組載體，輔助重組質粒分別包含ndv的np蛋白、p蛋白、f蛋白和l蛋白基因；其中p蛋白的237位和240位的氨基酸分別為t和i；

將輔助重組質粒和一個全基因組重組載體轉入到表達t7rna聚合酶的細胞系中，培養獲得基因vii型新城疫病毒弱毒株。

本發明篩選的構建的弱毒株，為基因vii型新城疫病毒rsl株，其于2017年3月20日保藏于中國武漢、武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno:v201709；

所述的疫苗為滅活疫苗，是通過甲醛對弱毒株進行滅活。

本發明構建的基因vii型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗均能誘導產生較高的中和抗體，能抵抗強毒力基因vii型新城疫病毒的侵害，有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1：新城疫f基因片段pcr鑒定圖；

圖2：ndv毒株(wf株、sl株)基于f基因片段的系統發生樹；

圖3：新城疫9個基因片段pcr鑒定結果圖；

圖4：全基因組分段構建pcr鑒定結果圖；

圖5：np、p、l輔助質粒酶切鑒定圖。

具體實施方式

本發明通過對臨床分離的兩株基因vii型ndv進行研究，發現一株為中等偏弱毒力毒株(wf株)，一株為強毒株(sl株)；通過對它們的基因組測序，并與ncbi公布的基因vii型ndv的p基因進行大量比對，發現wf株在p蛋白的第237位和第240位氨基酸與其它毒株不同，推測其可能與新城疫的毒力有關。按照wf株的p蛋白的序列對sl株的p基因進行改造，結果獲得了一株高度致弱的基因vii型新城疫疫苗侯選株。分別研究wf株和改造后的sl株的生物學特性，并分別做成滅活苗免疫動物后，能提供很好的免疫保護效果；從而促成了本發明。

下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。

實施例1基因vii型ndv野毒株的篩選及序列分析

從臨床發病雞中分離到兩株疑似ndv毒株，接種雞胚收取尿囊液，測定ha效價。根據ncbi公布的ndv的f基因序列設計引物，鑒定新城疫毒株。上游引物：ndvf‐f：atgggctccaaaccttctaccag；下游引物：ndvf‐r：aaactgctgcatcttcccaaccg。

取收取的尿囊液250ul按常規方法提取rna，反轉錄。以ndvf‐f/ndvf‐r為引物擴增f基因的部分片段，片段大小約500bp。核酸電泳后，切取陽性條帶，回收，連接t載體測序。取f基因47nt‐420nt之間的序列繪制基因進化樹，分析分離毒株的基因型。用于試驗分析的毒株genbank登錄號為：1‐2(ay935499)、1‐2(ay935500)、18719‐03(gq288385)、b1(nc_002617)、hb92(ay225110)、herts(ay741404)、italien(eu293914)、js‐07(fj766527)、lasota(af077761)、na‐1(dq659677)、paramyxovirus‐1(aj880277)、zj1(af431744)、mukteswar(ef201805)。

結果顯示，兩株分離毒株為新城疫病毒，f基因裂解位點的氨基酸序列均為¹¹²r-r-q-k-r-f¹¹⁷，符合強毒株的特征，進一步的基因進化分析顯示它們為基因vii型毒株。ha效價測定顯示，兩株病毒雞胚尿囊液的效價分別穩定在2⁹和2⁷‐2⁸。分離的ndv毒株分別命名為wf株和sl株。其中基因vii型新城疫病毒弱毒株wf株，其于2017年3月7日保藏于中國武漢、武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno:v201708。

實施例2新城疫sl株和wf株mdt、icpi的測定

mdt是指最小致死量所能使雞胚死亡的平均時間，mdt低于60h為強毒力ndv毒株；mdt值在60h‐90h之間為中等毒力毒株；mdt大于90h的為弱毒株。用無菌生理鹽水將新鮮收獲的含毒尿囊液作10倍系列稀釋，取10^‐6、10^‐7、10^‐8和10^‐94個稀釋度，分別接種10日齡雞胚，每個稀釋度接種5枚，每胚尿囊腔內注射0.1ml。每天上午和下午各照胚一次，記錄每一雞胚的死亡時間，連續觀察7日。(結果見表1)mdt計算公式為：

icpi是指1日齡雛雞腦內致病指數。取1日齡spf雛雞15只，各腦內注射10^‐1稀釋的新鮮含毒尿囊液0.05ml。另取5只以同樣方法注射相同劑量的無菌生理鹽水各0.05ml作為對照。接種后，每日在相應接種的時間觀察，記錄雛雞的情況，分正常(活動靈活，行動無共濟失調現象)、發病(包括麻痹、臥地不起，但不包括只表現遲鈍的雞)和死亡。

觀察8日，計算正常、發病、死亡雞的總數，根據不同的權值(正常為0，發病為1，死亡為2)累計總分數。

icpi為累計總分除以正常、發病和死亡動物的累計總數的平均值(結果見表1)。

表1：wf株和sl株mdt、icpi的測定

上述結果顯示，sl株符合強毒株的特征，與f基因裂解位點的強毒株特性一致；而wf株的f基因裂解位點雖然也符合強毒株的特征，但表1結果表明wf株屬于中等偏弱毒株，證明新城疫的毒力不僅僅與f蛋白有關，推測可能還與其它蛋白如p蛋白等有關。

實施例3：新城疫wf株、sl株全基因組序列的測定

為了確定是否p蛋白也產生了變異，根據ncbi公布的ndv基因序列，設計9對引物，相鄰擴增片段之間有部分核酸序列相互重疊。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表2。

表2擴增ndvsl株全基因組的引物序列

常規方法提取病毒rna，反轉錄，上述引物進行pcr擴增，連接pmd19‐t載體測序，測的的序列在ncbi網站比對，用lasergene軟件拼接，獲得wf株和sl株全基因序列。

結果顯示，wf株和sl株基因組全長15192bp，與lasota等毒株相比，在第1646‐1647位堿基之間都有多余的6個堿基，符合基因vii型新城疫毒株的特性。

進一步將wf株和sl株的p基因與ncbi公布的其它基因vii型新城疫病毒的p基因進行比對發現，wf株p蛋白(其氨基酸序列為seqidno:1)的第237位和第240位氨基酸與其它毒株有差異，其它毒株包括sl株p蛋白第237位和240位的氨基酸均為k/r和k，而wf株分別為t和i。

實施例4：基因vii型新城疫病毒致弱株的構建

通過反向遺傳操作技術驗證wf株p蛋白的變異是否就是導致wf株成為弱毒株的原因所在。反向遺傳操作技術一般是指通過構建病毒的基因組cdna克隆，在培養細胞或/和易感宿主中重新“復活”病毒，通過基因插入或缺失等方法修飾病毒的基因組序列，以此來進行病毒的功能基因組研究和新型疫苗的研制。本實施例的ndv的拯救過程是將構建的全基因組cdna克隆(轉錄載體)和分別含np、p和l基因的輔助質粒(表達載體)共轉染細胞，在輔助質粒提供有關酶的作用下，cdna克隆進行轉錄和各基因的表達，最終組裝成有感染性的病毒粒子，然后通過接種雞胚來大量擴增病毒而獲得拯救的ndv。拯救出的ndv基因組最終來源于cdna克隆。

下面對具體的步驟進行描述。

1)表達t7rna聚合酶的細胞系的構建

挑取大腸桿菌bl21單個克隆，試管搖菌，取400ul菌液，13000rpm/min離心10分鐘，去上清；用超純水重懸后離心，去上清；用100ul的超純水重懸，煮沸10min，冰浴10min；離心，取上清作為dna模板。根據ncbi公布的bl21菌株t7rna聚合酶基因序列，設計引物：t7‐f：5'ctgctcgagccaccatgaacacgattaacatcgctaagaacgac3'，t7‐r：5'ctgtctagattacgcgaacgcgaagtccgactctaagatgt，上游引物含xhoi酶切位點，下游引物含xbai酶切位點。以制備的dna作為模板進行pcr擴增，擴增片段大小約2.6kb。

取5ulpcr產物進行核酸電泳鑒定，若條帶正確，將剩余的pcr產物用核酸純化試劑盒進行純化。純化產物與真核表達載體pci‐neo一起進行xbai/xhoi雙酶切反應。回收陽性條帶，用t4dnaligase進行連接。轉化，質粒的小量提取，酶切鑒定等按常規方法進行。陽性質粒送上海生工生物工程有限公司測序，獲得重組質粒pci‐t7。

用含10％胎牛血清的dmem培養基培養df1細胞，均勻接種于60mm的dish培養皿，待細胞長至70％‐90％時轉染。取2ug的pci‐t7重組質粒，按磷酸鈣轉染試劑盒說明書的要求轉染df1細胞。轉染后4h換成新鮮的不含g418的生長培養基，24h后換成含400ng/mlg418的生長培養基。初次傳代換成含600ng/mlg418的生長培養基，以后傳代逐漸提高g418的濃度，直至g418的濃度達到1mg/ml。細胞連續傳代20代，提取rna，用dna酶處理后反轉錄，用引物t7‐f/t7‐r擴增，鑒定t7rna聚合酶的表達情況。

經鑒定，構建的細胞系可穩定傳代，并且轉染獲得的t7rna聚合酶基因可持續表達。將構建的穩定表達t7rna聚合酶的細胞系命名為df1‐t7。

2)sl株全長cdna克隆載體的構建

根據測得的sl株全基因組序列，用oligo7軟件分析其酶切位點。，將全基因組分成7段，分段連接到經過改造的載體pbrt上。其中，將p基因中第710位和719位堿基突變改造后再進行連接，構建的全長cdna克隆載體命名為pbrt-ndv-p，測序正確后，保存備用。在構建的pbrt-ndv-p載體基礎上，將第3段中f基因代表強毒株特性的堿性氨基酸裂解位點突變為低致病性特征的序列，構建的全長cdna克隆載體命名為pbrt-ndv，測序正確后，保存備用。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表3。其中cl2‐t1/cl2‐t2/cl2‐t3/cl2‐t4為f基因突變引物，cl2‐2f/cl2‐t5/cl2‐t6/cl2‐2r為p基因突變引物。

表3：ndv全基因組載體構建用引物序列

3)輔助質粒的構建

分別在sl株np、p和l基因的上下游引入酶切位點，pcr擴增后酶切，連接經相同內切酶處理過的pci‐neo載體，測序后保存，分別命名為pci‐np、pci‐p和pci‐l。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表4。

表4：ndv輔助質粒構建用引物序列

4)病毒拯救

df1‐t7細胞接種于35mm六孔板內生長至70％‐80％單層時，將轉錄質粒pbrt‐ndv‐p及輔助質粒pci‐np、pci‐p和pci‐l分別以5ug、2.5ug、1.25ug、1.25ug的比例，共轉染df1‐t7細胞系，采用磷酸鈣轉染試劑盒，操作按試劑盒說明書進行。同時，將轉錄質粒pbrt‐ndv與上述輔助質粒按相同的量和方法共轉染df1‐t7細胞系。轉染3‐5天后，收獲培養物上清接種9‐11日齡的spf雞胚尿囊腔，培養3‐5天，取雞胚尿囊液測ha效價。收獲ha試驗結果陽性尿囊液，分裝后‐70℃凍存。

將拯救的僅p基因改造的毒株命名為rsl‐p株，基因vii型新城疫病毒rsl‐p株，其于2017年3月20日保藏于中國武漢、武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno:v201710；

將拯救的p和f基因共同改造的毒株命名為rsl株；基因vii型新城疫病毒rsl株，其于2017年3月20日保藏于中國武漢、武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno:v201709；

轉染液接胚4天后收獲尿囊液，血凝(ha)試驗陽性，雞胚效價在2⁶‐2⁸之間。收獲的尿囊液1:1000‐1:10000稀釋，繼續接胚，0.1ml/枚，4‐5天后收胚；繼續傳代至第15代。分別取rsl‐p株和rsl株原代、第5代、第10代和第15代病毒尿囊液提取rna，pcr擴增突變的序列位點(p基因和p/f基因)并測序，鑒定結果與預期的結果一致。表明病毒拯救成功，且傳代穩定，改造的位點沒有再次發生回復突變。

實施例5、新拯救病毒(rsl‐p株和rsl株)的雞胚平均致死時間(mdt)

用無菌生理鹽水將新收獲的含毒尿囊液作10倍系列稀釋，取10^‐7、10^‐8、10^‐93個稀釋度，分別接種10日齡雞胚，每個稀釋度接種5個雞胚，每胚尿囊腔內注射0.1ml，每天在接種的相同時間照蛋1次，記錄每一雞胚的死亡時間，并測定ha活性。連續觀察7日，接種雞胚全部死亡的最高稀釋度即為最小致死量。

結果顯示，rsl‐p株的mdt值為108h，rsl株的mdt值為128h，具體結果見表5。

表5：rsl‐p株、rsl株雞胚平均致死時間(mdt)的測定

實施例6、rsl‐p株、rsl株腦內致病指數的測定(icpi)

取1日齡spf雛雞10只，各腦內注射10^‐1稀釋的新鮮含毒尿囊液0.05ml。另取5只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0.05ml。

接種后，每日在相應接種時間觀察，記錄雛雞的情況，分正常、發病和死亡。觀察8日，計算正常、發病、死亡雞的總數，根據不同的權值(正常為0，發病為1，死亡為2)累計總分數。icpi為累計總分除以正常、發病和死亡雞的累計總數的平均值。

結果顯示，rsl‐p株的icpi值為0.9，rsl株的icpi為0.35，具體結果見表6。

表6：rsl‐p株、rsl株icpi的測定

實施例7、rsl‐p株、rsl株靜脈致病指數的測定(ivpi)

取6周齡spf雞10只，各靜脈接種10^‐1稀釋的含毒尿囊液0.1ml，另取5只接種生理鹽水作對照。每日在接種的相應時間觀察，記錄接種雞情況，分正常、發病、麻痹和死亡。

觀察10日后，累計正常、發病、麻痹和死亡動物數，根據不同權值(正常為0，發病為1，麻痹為2，死亡為3)累計總分數。ivpi為累計總分除以正常、發病和死亡動物的累計總數。

結果顯示，rsl‐p株、rsl株的ivpi值均為0，具體結果見表7。

結合兩株拯救毒株mdt、icpi和ivpi值的測定結果分析，rsl‐p株的毒力較野生株sl株的毒力已經大幅下降，說明p基因的兩個位點確實影響著sl株的毒力，而通過p基因和f基因聯合改造獲得的rsl株毒力完全下降，完全符合低毒力毒株的特性，作為疫苗候選株能更加保證疫苗使用的安全性。

表7：rsl‐p株、rsl株ivpi的測定

實施例8、wf株、rsl‐p株和rsl株病毒的滅活及滅活后的穩定性試驗

通過上述一系列驗證發現，wf株和rsl‐p株、rsl株在生物安全性上均有保證，均有作為疫苗侯選株的潛力。

將收獲的wf株、rsl‐p株、rsl株新鮮病毒尿囊液(eid50為10^9.5/0.1ml)中，加入終濃度為0.1％的甲醛溶液，37℃滅活24h，置于4℃保存。分別于滅活后0h、24h、48h、7天、15天、1個月測定ha效價，測定滅活病毒的穩定性，結果見表8。另取滅活后的原液，接種10日齡spf雞胚10枚，0.1ml/枚，37℃培養120h，收胚測效價，檢驗滅活徹底性。

結果顯示，滅活后的病毒較為穩定，放置一段時間后，ha效價沒有顯著下降。并且滅活較為徹底，滅活后的抗原原液接種雞胚沒有死亡，ha效價全部陰性。

表8：滅活后抗原ha效價

實施例9、wf株、rsl-p株、rsl株油佐劑滅活疫苗的制備及安全性試驗、無菌檢驗

滅活后的病毒原液，按常規方法制備油佐劑滅活疫苗。每組滅活苗分別用7日齡spf雞10只，每只頸部皮下注射疫苗1.0ml，同時各設對照5只，在相同的條件下飼養，連續觀察14日，記錄試驗雞采食、飲水及臨床情況。結果顯示，免疫后疫苗吸收效果良好，免疫雞沒有出現任何局部和全身的不良反應，雞的狀態完全正常。

取制備的wf株、rsl-p株、rsl株油佐劑疫苗，按2010年版《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗，結果符合標準，沒有細菌污染。

實施例10、wf株、rsl-p株、rsl株油佐劑滅活疫苗的免疫效果評價

21日齡spf雞50只，隨機分為五組，一組為陰性對照組，一組為wf株疫苗免疫組，一組為rsl-p株疫苗免疫組，一組為rsl株疫苗免疫組，另一組為lasota株免疫組。免疫組每只頸部皮下注射疫苗0.2ml，對照組免疫相同劑量的pbs，免疫組與對照組隔離飼養。分別于免后21天、28天采血，分離血清，測定抗體。28天采血后，用臨床分離的基因vii型野毒株強毒wh株攻毒，每只雞肌肉注射10⁶eid50，隔離器飼養，觀察14天，每天記錄雞的發病和死亡情況；攻毒后第3天，采集四組免疫組雞的喉拭子和泄殖腔拭子接胚，檢測排毒情況。

結果顯示，免疫組免疫21天后均可產生較高水平抗體，28天抗體水平更高，結果見表9所示。攻毒后，免疫組沒有出現任何死亡，而5天后陰性對照組雞全部死亡。排毒情況顯示，免疫wf株、rsl-p株、rsl株疫苗的動物沒有出現排毒，而lasota株仍有排毒現象，見表10和表11所示。

表9：免疫后抗體效價測定

表10：免疫效力實驗結果

表11:攻毒后第3天病毒分離結果

綜上所述，本發明所構建的弱毒株，通過將它們做成疫苗免疫動物后發現，均能誘導產生較高的中和抗體，能抵抗強毒力基因vii型新城疫病毒的侵害，有廣闊的應用前景。

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<110>山東信得科技股份有限公司

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