一種用于組織工程的三維復合多孔支架及其制備方法與流程

本發明屬于組織工程的技術領域，涉及一種用于組織工程的三維復合支架及其制備方法，尤其涉及力學框架復合天然高分子及其衍生物復合支架的制備方法。

背景技術：

組織工程三大要素之一支架材料起到細胞外基質作用。支架必須滿足良好的生物相容性、一定的孔隙率和良好的力學支撐。

支架的制備方法有相分離法、氣體發泡法、粒子瀝濾法等傳統方法和快速成型技術。相分離法是在一個多組分均相系統里，通過分離以聚合物為連續相和以溶劑為分散相。經過冷凍干燥得到多孔支架。相分離的工藝較為復雜，不能得到孔徑精確控制支架。氣體發泡發是浸泡在高壓二氧化碳的片狀聚合物降壓到常態，使得氣泡增大成核，在聚合物內部形成多孔結構。雖然二氧化碳氣體發泡法避免了使用有機溶劑，但也難以精確控制支架的形狀和空隙，孔尺寸。顆粒瀝濾法是聚合物溶解后加入糖、氯化鈉等造孔劑攪拌均勻，然后放入模具成型至溶劑揮發，用去離子水除去造孔劑烘干形成多孔支架。這種方法除有溶劑殘留和無法精確控制空隙率外，還有可能導致閉孔、連通性差等問題。3d打印方法可以克服傳統支架制備方法的不足，如孔連通性不好、孔隙率無法控制、孔尺寸大小等問題。

支架材料可以為合成材料也可以為天然材料。但是合成材料由于缺乏能夠與細胞相互作用的識別位點，其生物活性也有待進一步提高。天然材料具有良好的生物相容性和可降解性，天然材料成分接近細胞外基質成分，為細胞的粘附和增殖提供了更加理想的材料環境，且材料降解之后有可能為細胞提供合成蛋白的營養成分，如膠原和纖維蛋白等，或提供碳水化合物等成分，如海藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和透明質酸等。天然生物材料雖具有良好的生物相容性，但其機械強度差和降解速率不可控，在實際應用中受到一定程度的局限。

將天然材料的生物活性與可降解合成材料良好的力學特性結合起來，充分利用兩者的優勢，制備出復合支架能夠為未來應用提供性能更加優良的材料支架。由于合成可降解材料與天然材料相互之間的不相容性，以及天然材料的溫度敏感特性，很難用傳統的材料成型加工工藝將二者進行復合。而采用表面改性的方法，可以將天然生物材料在合成材料表面進行接枝修飾，但采用表面修飾的方法，天然材料的復合量較少，降解后期生物活性將受到一定程度的影響。

采用本發明的復合方法，分別利用天然材料以及合成材料的傳統成型方法，進行同一復合支架的制備，使得復合支架既具有合成材料力學性能突出的優勢，又具有天然材料生物活性優良的特點，其相應的孔徑孔隙率可以分別對成型方法工藝的調控進行綜合控制，從而使得復合支架具有良好的力學性能及生物學性能，以及適于組織再生的孔徑與孔隙率。

技術實現要素：

為了克服現有技術的缺點和不足，本發明的目的在于提供了一種用于組織工程的三維復合多孔支架的制備方法。本發明能夠將力學性能優異的材料和良好生物活性的材料進行復合，使得復合后的材料具有良好的力學性能及生物活性，可用于組織工程研究。

本發明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的用于組織工程的三維復合多孔支架。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種用于組織工程的三維復合多孔支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)將高分子材料或高分子材料與無機粉體的混合物按照所需的結構進行三維打印，得到具有孔隙的框架即支架；所述高分子材料為聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內酯或聚氨酯中的一種以上；

(2)將天然材料溶液或天然材料與無機粉體的混合溶液進行抽真空處理，然后灌注入步驟(1)的支架的孔隙中，得到支架與混合溶液的混合物；所述天然材料為天然高分子和/或天然高分子衍生物；

(3)將步驟(2)的混合物進行冷凍干燥，得到三維復合多孔支架；

(4)或者將步驟(2)的混合物進行冷凍干燥和交聯處理，得到三維復合多孔支架；所述交聯處理是指在冷凍干燥前或冷凍干燥后將混合物進行交聯處理，交聯處理的方式為采用交聯劑進行交聯或真空熱交聯；當采用交聯劑進行交聯時，交聯后需除雜，冷凍干燥。

步驟(1)中所述高分子材料的數均分子量為30000～100000。

步驟(1)中所述無機粉體為羥基磷灰石或磷酸三鈣中一種以上。

步驟(1)中所述無機粉體的粒徑為20～100nm。

步驟(1)中所述高分子材料與無機粉體的重量比為(3～9):1。

步驟(2)中所述天然高分子為膠原、透明質酸、殼聚糖或海藻酸鈉中一種以上；所述天然高分子衍生物是指上述所述天然高分的衍生物，如：接枝多肽的膠原。

步驟(2)中所述無機粉體為羥基磷灰石或磷酸三鈣中一種以上。

步驟(2)中所述無機粉體的粒徑為20～100nm。

步驟(2)中所述天然材料溶液的濃度為0.1-10mg/ml；所述混合溶液的濃度為0.1-10mg/ml，天然材料與無機粉體的質量比為1:1。

步驟(1)中所述三維打印的溫度高于高分子材料的熱熔溫度，但低于高分子材料分解溫度。

步驟(3)中所述冷凍干燥的溫度為-80～-20℃，冷凍干燥的時間為36～48h。

步驟(4)中所述交聯劑為edc/nhs體系，戊二醛溶液或氯化鈣溶液，交聯劑的質量濃度為0.1％～1％。

步驟(4)中所述交聯劑進行交聯時，交聯的溫度為-8℃～常溫，當交聯劑為edc/nhs體系或戊二醛溶液時，交聯的溫度優選為-8℃～4℃；當交聯劑為氯化鈣溶液時，交聯的溫度為常溫。

步驟(4)中所述交聯劑進行交聯時，交聯的時間為4～24h。

步驟(4)中所述真空交聯的溫度為90℃～160℃；真空交聯的時間為24～48h。

步驟(1)中所述支架的平均孔尺寸為0.1mm-1.5mm，孔隙率為20％-90％。

與現有技術相比，本發明具有以下優點和有益效果：

本發明通過三維打印的方式制備支架，孔結構和孔隙率可控，便于實現；本發明提供三維復合多孔支架的制備方法，工藝簡單、操作方便；三維復合多孔支架具有良好的力學性能和生物活性。

附圖說明

圖1為實施例1中聚氨酯支架即未填充膠原的支架的光學顯微鏡照片；

圖2為實施例2中聚氨酯支架即未填充膠原的支架的光學顯微鏡照片；

圖3為實施例1中三維復合多孔支架即三維打印聚氨酯填充膠原之后的sem圖；

圖4為實施例2中三維復合多孔支架即三維打印聚氨酯填充膠原之后的sem圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明做進一步地詳細描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例1

聚氨酯/膠原三維復合多孔支架的制備：

(1)將聚氨酯(數均分子量mn＝61148)進行三維打印(打印框架時的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為200μm；該聚氨酯支架即未填充膠原的支架的光學顯微鏡照片如圖1所示；

(2)將0.4mg/ml的膠原水溶液真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯支架內部，冷凍干燥(-40℃干燥48h)獲得未交聯的復合支架；

(3)將未交聯的復合支架浸沒在碳化二亞胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交聯水溶液(交聯水溶液的總質量的濃度為0.3％，edc/nhs的摩爾比＝1:1)中進行交聯，交聯的溫度為4℃，交聯時間為4h，交聯完畢后，用甘氨酸中和未反應的edc，超清洗10次后，-40℃冷凍干燥48h，得到聚氨酯支架/膠原一體化支架即三維復合多孔支架。所述三維復合多孔支架即三維打印聚氨酯填充膠原之后的sem圖如圖3所示。本實施例所制備的三維復合多孔支架壓縮模量為6.3±0.5mpa，孔隙率為62.3％。

實施例2

聚氨酯/膠原三維復合多孔支架的制備：

(1)將聚氨酯(數均分子量mn＝61148)進行三維打印(打印框架時的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為400μm；聚氨酯支架即未填充膠原的支架的光學顯微鏡照片如圖2所示；

(2)將0.4mg/ml的膠原水溶液真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯支架內部，采用冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)獲得未交聯的復合支架；

(3)將未交聯的復合支架浸沒在碳化二亞胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交聯溶液(交聯水溶液的總質量的濃度為0.3％，edc/nhs的摩爾比＝1:1)中進行交聯，交聯的溫度為4℃，交聯時間為4h，交聯完畢后，用甘氨酸中和未反應的edc，超清洗10次后，-40℃冷凍干燥48h，得到聚氨酯支架/膠原一體化支架即三維復合多孔支架。本實施例的三維復合多孔支架即三維打印聚氨酯填充膠原之后的sem圖如圖4所示。本實施例所制備的三維復合多孔支架的壓縮模量為6.,2±0.5mpa，孔隙率為81.2％。

實施例3

聚氨酯/海藻酸鈉三維復合多孔支架的制備：

(1)將聚氨酯(數均分子量mn＝61148)進行三維打印(打印框架時的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為1500μm；

(2)將0.2mg/ml的海藻酸鈉水溶液真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯支架內部，然后浸泡在質量濃度為1％的氯化鈣溶液中交聯12h，用去離子水洗滌5次，在-20℃冷凍干燥48h，得到三維復合多孔支架。本實施例所制備的三維復合多孔支架的壓縮模量為6.3±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

實施例4

聚己內酯/膠原三維復合多孔支架的制備

(1)將聚己內酯(聚己內酯的數均分子量mn＝90000)進行三維打印(打印框架時的條件：溫度為t＝160℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚己內酯框架即聚己內酯支架，平均孔尺寸為200μm；

(2)將0.4mg/ml的膠原水溶液真空脫氣泡后，灌注到聚己內酯支架內部，冷凍干燥(-40℃干燥48h)，得到未交聯的復合體；

(3)將未交聯的復合體(即聚己內酯支架/膠原復合體)浸沒在碳化二亞胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交聯溶液(交聯水溶液的總質量的濃度為0.3％，edc/nhs的摩爾比＝1:1)進行交聯，交聯的溫度為4℃，交聯時間為4h，交聯完畢后，用甘氨酸中和未反應的edc，超清洗10次后冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)，得到聚己內酯支架/膠原一體化支架即三維復合多孔支架。本實施例所制備的三維復合多孔支架的壓縮模量為12.5±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

實施例5

聚己內酯/磷酸三鈣三維復合多孔支架制備：

(1)將聚己內酯(數均分子量mn＝90000)與磷酸三鈣(粒徑為20～100nm)進行擠出共混，得到聚己內酯/磷酸三鈣復合材料(聚己內酯與磷酸三鈣的質量比為90:10)；將聚己內酯/磷酸三鈣復合材料進行三維打印(打印框架時的條件：溫度為t＝180℃，壓力p＝3.5bar)，得到三維聚己內酯/磷酸三鈣支架，平均孔尺寸為100μm；

(2)將3mg/ml殼聚糖的乙酸溶液(采用0.1wt％的醋酸水溶液配制成殼聚糖的濃度為3mg/ml)真空脫氣泡后，灌注到聚己內酯/磷酸三鈣多孔支架內部，然后在-20℃冷凍干燥48h獲得聚己內酯/磷酸三鈣/殼聚糖三維復合支架即三維復合多孔支架。本實施例所制備的三維復合多孔支架的壓縮模量為6.3±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

實施例6

聚氨酯/膠原/羥基磷灰石三維復合多孔支架制備：

(1)將聚氨酯(數均分子量mn＝61148)進行三維打印(打印框架時的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為200μm；

(2)采用水將膠原和羥基磷灰石(粒徑為20～100nm)配制成漿料(膠原：羥基磷灰石質量比為1:1，漿料中膠原和羥基磷灰石總的濃度為1mg/ml)，得到膠原/羥基磷灰石漿料；

(3)將膠原/羥基磷灰石漿料真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯框架中，得到未交聯的復合體；

(4)將未交聯的復合體浸沒在質量濃度為0.2％戊二醛的乙酸水溶液(溶液中乙酸的濃度為0.05mol/l)中，4℃下，交聯24h，然后在-20℃冷凍干燥48h，獲得聚氨酯/膠原/羥基磷灰石復合支架即三維復合多孔支架。本實施例所制備的三維復合多孔支架的壓縮模量為6.3±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

實施例7

(1)將聚乳酸(分子量為70000)進行三維打印(打印框架時的條件：溫度為t＝150℃，壓力p＝3.5bar)，得到三維聚乳酸框架即聚乳酸支架，平均孔尺寸為200μm；

(2)將膠原溶液真空脫氣泡后，灌注到三維聚乳酸框架內部，采用冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)，得到未交聯的復合體；

(3)將未交聯的復合體于110℃真空熱交聯48h，保持真空降溫得到熱交聯的聚乳酸支架/膠原一體化支架即三維復合多孔支架。本實施例所制備的三維復合多孔支架的壓縮模量為7.6±0.4mpa，孔隙率為80.3％。

實施例8

聚氨酯支架/膠原三維復合多孔支架制備：

(1)將聚氨酯(數均分子量mn＝61148)進行三維打印(打印框架時的條件：溫度為t＝205℃，壓力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸為200μm；

(2)將膠原溶液真空脫氣泡后，灌注到聚氨酯支架內部，冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)，得到未交聯的復合體；

(3)將未交聯的復合體即聚氨酯支架/膠原復合體浸沒在質量濃度為0.2％戊二醛的乙酸水溶液(溶液中乙酸的濃度為0.05mol/l)中，4℃下，交聯24h，交聯完畢后，用pbs緩沖液和去離子水超清洗10次，然后冷凍干燥(-40℃冷凍干燥48h)，得到聚氨酯支架/膠原一體化支架即三維復合多孔支架。本實施例所制備的三維復合多孔支架的壓縮模量為6.3±0.5mpa,孔隙率為62.1％。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但是本發明的實施方式不受上述實例限制，其他的任何未背離本發明精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化均為等效。