REG1A蛋白在制備治療和/或預防視網膜細胞凋亡藥物中的應用的制作方法

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及reg1a蛋白在制備治療和/或預防視網膜細胞凋亡藥物中的應用。
背景技術：
：光作用于視覺器官，使其感受細胞興奮，其信息經視覺神經系統加工后便產生視覺。通過視覺，人和動物感知外界物體的大小、明暗、顏色、動靜，獲得對機體生存具有重要意義的各種信息，至少有80％以上的外界信息經視覺獲得，視覺是人和動物最重要的感覺。視覺器官眼睛的視網膜上億的神經細胞排列成三層，通過突觸組成一個處理信息的復雜網絡。第一層是光感受器，第二層是中間神經細胞，包括雙極細胞、水平細胞和無長突細胞等，第三層是神經節細胞。它們間通過突觸連接，無論視網膜上的哪種細胞發生變性或病變都會影響正常視覺，進而給患者的正常生活造成影響。隨著對視網膜細胞凋亡誘導誘導因素基因調控等方面的深入研究，發現視網膜細胞的凋亡與眼底病變關系密切，常見的視網膜細胞凋亡導致的疾病有很多，例如老年性黃斑變性，視網膜色素膜變性，椎體桿體細胞營養不良和青光眼等。針對視網膜細胞凋亡導致的病變，通過預防或防治視網膜細胞凋亡的發生，將可能成為防治疾病的可靠途徑。目前，針對視網膜細胞凋亡疾病的治療手段較多，例如，視網膜的移植，但是該方法可能會造成慢性排斥反應，同時對患者的生理和心理造成很大的創傷。另外，基因治療是利用載體、化學或物理方法將正常基因導入眼組織相應細胞內讓其表達，但是基因治療的機理尚不能完全明確，并且目的基因有效轉染、功能基因的長期持續表達等問題也有待解決，因此，基因治療方法還需要深入研究才能夠應用于臨床。技術實現要素：有鑒于此，本發明的目的在于提供reg1a蛋白在制備治療和/或預防視網膜細胞凋亡藥物中的應用，使該應用作用機理清楚，治療效果顯著。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了reg1a蛋白在制備治療和預防視網膜細胞凋亡藥物中的應用。優選的，reg1a蛋白通過與視網膜細胞表面的受體extl3結合，抑制視網膜細胞凋亡。優選的，所述的視網膜細胞包括感光細胞和視網膜色素上皮細胞。優選的，藥物的劑型包括注射劑。優選的，所述注射劑包括reg1a蛋白和可接受的輔料。優選的，所述注射劑中reg1a蛋白的濃度為0.6～2.5mg/ml。優選的，所述的輔料包括0.9％氯化鈉溶液。本發明提供了reg1a蛋白在制備治療和/或預防視網膜細胞凋亡藥物中的應用。本發明所述應用提供了一個治療和/或預防視網膜細胞凋亡新的作用蛋白，所述reg1a蛋白通過與視網膜細胞表面的受體extl3結合，抑制視網膜細胞凋亡。本發明提供的應用沒有發現有毒副作用；具有用量小、安全、長期穩定，機體無排除反應等優點，適用于臨床治療。進一步的，本發明提供的應用能夠治療和/或預防感光細胞和視網膜色素上皮細胞凋亡引起的視網膜變性。附圖說明圖1為實施例1中小鼠各個組織器官中reg1a的表達量的電泳圖；圖2為實施例2中小鼠視網膜中reg1a的定位的免疫熒光圖片；圖3為實施例3中分析重組蛋白his-reg1a表達的sds-page電泳圖；圖4為實施例3中重組蛋白reg1a與商業蛋白考馬斯亮藍染色情況和westernblotting結果；圖5為實施例4中reg1a蛋白對光照誘導的感光細胞凋亡的影響趨勢；圖6為實施例4中reg1a抑制661w細胞光損傷的細胞形態圖片；圖7為實施例5中重組reg1a蛋白對rpe細胞活力的影響趨勢；圖8為實施例6中reg1a的受體extl3在661w細胞及arpe-19細胞中表達的電泳圖；圖9為實施例6中reg1a的受體extl3在視網膜光感受器的外節表達的免疫熒光圖片；圖10為實施例7中reg1a蛋白抑制離體培養視網膜細胞凋亡結果。具體實施方式本發明提供了reg1a蛋白在制備治療和預防視網膜細胞凋亡藥物中的應用。本發明中，所述視網膜細胞凋亡優選是由光照誘導產生的。本發明中，所述reg1a蛋白通過與視網膜細胞表面的受體extl3結合，抑制視網膜細胞凋亡。本發明中，所述的視網膜細胞優選包括感光細胞和視網膜色素上皮細胞。本發明中，藥物的劑型優選包括注射劑。本發明中，所述注射劑優選包括reg1a蛋白和可接受的輔料。本發明中，所述reg1a蛋白的來源是由北京義翹神州生物技術有限公司合成。所述reg1a蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno10所示。本發明中，所述注射劑中reg1a蛋白的濃度優選為0.6～2.5mg/ml，更優選為0.625mg/ml。本發明中，所述的輔料優選包括無菌0.9％氯化鈉溶液。本發明還提供了所述藥物的制備方法，包括以下步驟：將0.6～2.5mg粉末狀reg1a蛋白制劑溶于0.1ml無菌0.9％氯化鈉溶液，重復溶解后，得到藥物。所述藥物作為添加劑加入離體視網膜培養系統，終濃度為0.6～2.5mg/ml，能明顯減少視網膜細胞的凋亡。下面結合實施例對本發明提供的reg1a蛋白在制備治療和/或預防視網膜細胞凋亡藥物中的應用進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。實施例1神經分泌因子reg1a基因在小鼠視網膜中表達情況取小鼠各部位作為實驗材料，包括胰腺、腎臟、心臟、皮膚、小腸組織、大腦、睪丸、脈絡膜、肝臟、脾臟、肺、額下腺、角膜、視網膜及晶狀體。將上述材料采用試劑盒法提取各材料的mrna。將提取的mrna經過質量檢測后，將完整性高的mrna進行半定量pcr檢測。具體是采用逆轉錄試劑盒將mrna逆轉錄成cdna，對reg1a基因進行半定量pcr反應，以gapdh作為內參基因，eg1a基因和mgapdh的引物序列見表1，pcr反應體系見表2，pcr程序見表3。表1reg1a基因和gapdh的引物序列表2reg1a基因和gapdh的pcr擴增體系成分體積2×powertaqpcrmastermix10μlprimer(f+r)2μlcdna2μlddh2o6μl總體系20μl表3reg1a基因和gapdh的pcr反應條件pcr反應結束，將pcr產物在0.1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，經過eb染色后再凝膠成像系統下觀察并拍照，電泳圖如圖1所示。由圖1中可以看出，reg1a在腎臟、小腸和胰腺中有很高的表達量，而且在眼睛的不同組織也有表達，包括角膜、視網膜及晶狀體，這說明在視網膜組織內表達reg1a基因。實施例2免疫染色步驟：解剖小鼠視網膜，放入4％多聚甲醛中固定1h，經15％和30％葡萄糖脫水處理后，放入oct包埋劑中包埋，制備冰凍切片；清洗，將視網膜切片放入dpbs中，置于搖床上緩慢漂洗3遍，每次5分鐘。漂洗結束，每孔加入500μl用dpbs配制的0.5％的tritonx-100穿透液，室溫通透細胞10分鐘，吸去穿透液。重復步驟3，每孔加入500μl用dpbs配制的3％的h2o2，室溫10min，去除過氧化物酶的影響。吸去h2o2，重復步驟3。用4％bsa(用dpbs配制)室溫封閉30min。吸去bsa后，重復步驟3。將reg1a抗體按1:100稀釋后，加入培養皿內，4℃孵育過夜。回收一抗，重復步驟3。將fitc標記的熒光二抗按1:200稀釋后加入細胞培養皿內，錫箔紙包被避光，室溫孵育1小時。吸去二抗，dpbs漂洗3次，加入dapi染色液，進行復染。并將蓋玻片蓋在滴有防淬滅劑的視網膜切片上面，蓋玻片周圍用指甲油封閉。待干燥后，在熒光顯微鏡下觀察，拍片并分析結果。以igg作為對照，按照上述方法進行免疫熒光實驗。視網膜中免疫熒光結果如圖2所示。由圖2可知，用免疫熒光染色的方法研究小鼠視網膜中reg1a的定位，發現reg1a特異性的表達在小鼠視網膜的神經節細胞層，而在視網膜其他細胞中均未見表達。實施例3重組reg1a蛋白的表達純化將reg1a基因按照實施例1中pcr擴增方法，得到reg1a基因片段的經過瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后得到大量reg1a基因片段。利用連接試劑盒，將回收的reg1a基因片段與pet28a載體進行酶切連接，得到重組載體。將重組載體轉化到大腸桿菌菌株bl-1中，搖床培養，培養得到的菌落經過菌落pcr驗證陽性菌。向陽性菌種加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)進行誘導表達，離心收集菌體，加入緩沖液，制成菌體混懸液，超聲波破碎，離心收集蛋白質。比較添加iptg前后細菌中蛋白表達變化，將提取的蛋白質進行page凝膠電泳，結果如如圖3所示，其中marker代表低分子量標準蛋白；+iptg：加入0.1mmiptg誘導的質粒pet28a-his-reg1a轉化的bl21全菌；-iptg表示未經iptg誘導的質粒pet28a-his-reg1a轉化的bl21全菌；r1-3表示經ni2+-ntaagaros純化的his-reg1a洗脫液1，2，3。從圖3中可以得到，加入iptg誘導后的菌落提取的蛋白質經過電泳分離，在20kda的位置有明顯的融合蛋白表達條帶，而未經iptg誘導的樣品對應位置無明顯條帶。這說明reg1a基因片段在重組菌種成功表達reg1a蛋白。實施例4661w細胞是鼠源感光細胞系，根據專利號為zl201310631831.4的專利公開的“溫度與光照可控型視網膜光損傷定量研究裝置”成功建立了光損傷661w細胞模型。用0.625mg/ml，1.25mg/ml和2.5mg/ml的重組reg1a蛋白預處理光損傷的661w細胞2h，然后予以10000lux光照刺激，此方案為實驗組。以未加入重組reg1a蛋白的一組作為對照。對實驗組和對照組進行形態學觀察并在光學顯微鏡下拍照，并且通過cellcountingkit檢測重組reg1a蛋白處理實驗組和對照組的細胞活力，兩組細胞活力見圖5，兩組細胞的形態如圖6所示。由圖5可以看出，發現光照后，未加入重組reg1a蛋白組，細胞活力顯著下降，約為實驗組的50％。但是加入不同濃度的reg1a蛋白均對細胞凋亡具有抑制作用，而且隨著蛋白濃度的增加，細胞活力顯著提高。說明reg1a蛋白能夠抑制光照引起的感光細胞凋亡。由圖6可以看出，611w細胞經過10000lux白光光照8h后，細胞形態發生明顯改變，細胞呈扁圓狀，貼壁不牢，是明顯的細胞凋亡狀態，而加入1.25mg/ml的reg1a蛋白的細胞形態與健康611w細胞形態變化不大，未見明顯凋亡細胞。從細胞形態可觀察到，加有reg1a蛋白處理后光照8h的661w細胞較未加reg1a蛋白的處理的細胞，其細胞狀態明顯變好。這些結果表明，神經分泌因子reg1a蛋白能夠抑制光照誘導的661w細胞凋亡。實施例5reg1a蛋白對rpe細胞系arpe-19細胞凋亡的抑制作用將arpe-19培養于低糖低血清的培養基中，一個月后，arpe-19細胞呈明顯的六邊形，并有少量色素形成，得到與體內的rpe細胞具有類似的特征的arpe-19細胞。向arpe-19細胞加入1.25mg/ml的重組reg1a蛋白，測定細胞活力，該組作為實驗組，以未加入重組reg1a蛋白細胞活力處理作為對照組，測定細胞活力。arpe-19細胞經10000lux白光光照8h后加入1.25mg/ml的重組reg1a蛋白，測定細胞活力，該組作為實驗組，以未加入重組reg1a蛋白細胞活力處理作為對照組，測定細胞活力。將四組測定的細胞活力建立柱狀圖，如圖7所示。從圖7可知，未經光照的實驗組和對照組細胞活力稍有差異，而經過光照的實驗組比對照組相比存在顯著差異，并且加入重組reg1a蛋白后細胞活性顯著提高，該結果證明重組reg1a蛋白對rpe細胞也具有明顯的保護作用。實施例6神經分泌因子reg1a蛋白干預光照誘導的細胞凋亡的機制檢測reg1a的受體extl3在661w細胞及arpe-19細胞中表達情況，以gapdh作為內參基因，擴增extl3和gapdh基因的引物和pcr反應程序為如表4所示，pcr反應體系如表5所示。擴增得到的pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳(如圖8中a部分所示)。按照實施例3中的方法制備重組extl3蛋白，并且對重組extl3蛋白進行蛋白印跡(如圖8中b部分所示)。由圖8可知，受體extl3在661w細胞及arpe19細胞中均有表達，而且，免疫熒光結果也證明了，受體extl3在小鼠視網膜中，主要在感光細胞中表達。采用實施例2中的免疫熒光檢測的方法檢測661w細胞及arpe19細胞中extl3的表達情況(如圖9。免疫熒光結果也證明了，受體extl3在小鼠視網膜中也表達，主要在視網膜光感受器的外節。基于上述結果，reg1a蛋白是有視網膜神經節細胞的分泌的一種神經營養因子，通過與感光細胞和rpe細胞表面的受體extl3結合，發揮作用。起到保護感光細胞和rpe細胞的作用，抑制感光細胞和rpe細胞的凋亡。表4.pcr引物及程序表5hextl3基因和gapdh的pcr擴增體系成分體積2×powertaqpcrmastermix10μlprimer(f+r)2μlcdna2μlddh2o6μl總體系20μl以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。實施例7神經分泌因子reg1a蛋白干預離體培養視網膜解剖剛出生小鼠視網膜(此時小鼠視網膜并未完全發育)，以傳統離體視網膜培養方法進行培養(有參考文獻)作為對照，將0.625mg/ml的reg1a蛋白添加至離體培養視網膜培養系統作為實驗組，將對照組和實驗組視網膜培養14天后，分別進行熒光染色和統計視網膜凋亡水平。reg1a蛋白抑制離體培養視網膜細胞凋亡結果見圖10，其中a為tunel檢測離體培養視網膜中細胞凋亡情況；b為統計的凋亡細胞數量。對照組和實驗組小鼠視網膜培養14天發育成結構穩定的三層結構，但是對照組視網膜細胞凋亡很多，而添加reg1a蛋白的實驗組較對照組，細胞凋亡明顯減少。由此可知，reg1a蛋白能有效抑制視網膜細胞凋亡。sequencelisting<110>溫州醫科大學<120>reg1a蛋白在制備治療和/或預防視網膜細胞凋亡藥物中的應用<130>2016<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ccatcaccatcttccaggag20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tccacagtcttctgggtggc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gtctccaagccaaggccagg20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ccagacattggcgtctgtag20<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5catcttccaggagcgagatcc21<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6caccactgacacgttggcagtg22<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ctccaactactcctgtgagc20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8gggagtcatcatgagacagg20<210>9<211>501<212>dna<213>人工序列<400>9atggctcagaccagctcatacttcatgctgatctcctgcctgatgtttctgtctcagagc60caaggccaagaggcccagacagagttgccccaggcccggatcagctgcccagaaggcacc120aatgcctatcgctcctactgctactactttaatgaagaccgtgagacctgggttgatgca180gatctctattgccagaacatgaattcgggcaacctggtgtctgtgctcacccaggccgag240ggtgcctttgtggcctcactgattaaggagagtggcactgatgacttcaatgtctggatt300ggcctccatgaccccaaaaagaaccgccgctggcactggagcagtgggtccctggtctcc360tacaagtcctggggcattggagccccaagcagtgttaatcctggctactgtgtgagcctg420acctcaagcacaggattccagaaatggaaggatgtgccttgtgaagacaagttctccttt480gtctgcaagttcaaaaactag501<210>10<211>166<212>prt<213>人工序列<400>10metalaglnthrsersertyrphemetleuilesercysleumetphe151015leuserglnserglnglyglnglualaglnthrgluleuproglnala202530argilesercysprogluglythrasnalatyrargsertyrcystyr354045tyrpheasngluasparggluthrtrpvalaspalaaspleutyrcys505560glnasnmetasnserglyasnleuvalservalleuthrglnalaglu65707580glyalaphevalalaserleuilelysgluserglythraspaspphe859095asnvaltrpileglyleuhisaspprolyslysasnargargtrphis100105110trpserserglyserleuvalsertyrlyssertrpglyileglyala115120125proserservalasnproglytyrcysvalserleuthrserserthr130135140glypheglnlystrplysaspvalprocysgluasplyspheserphe145150155160valcyslysphelysasn165當前第1頁12