一種具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系的制作方法

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系。

背景技術：

癌癥是威脅全球人類生命的最大殺手之一，是當前醫學研究領域所面臨的一個重大挑戰。腫瘤的發生是極其復雜的過程，原癌基因的異常激活、抑癌基因或凋亡相關基因的失活是導致細胞惡性增殖或凋亡的重要原因。其中，抑癌基因的點突變、重組、缺失或甲基化所致的功能失活與多種人類惡性腫瘤的發生和發展密切相關。因此，通過抑癌基因的轉移、表達，進而補償和替代缺失和突變的抑癌基因，是目前癌癥基因治療的主要策略之一。腫瘤抑制基因p53在細胞中編碼一個含393個氨基酸組成的磷酸化蛋白，其分子量為53kda，即p53蛋白。

研究表明，p53在dna損傷修復、細胞周期調控、誘導腫瘤細胞凋亡方面起著重要的作用，其中50％以上的人類腫瘤均是由于p53基因的突變或功能缺失所引起的。因此，重新導入野生型p53基因不僅可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,而且對抗腫瘤藥物所引起的dna損傷具有正向應答效應,激活凋亡程序，促使癌細胞執行“自殺”行為。因此，以野生型p53基因作為模型治療基因，并同時負載天然抗腫瘤藥物，以納米粒子作為傳輸載體，探索其誘導腫瘤細胞凋亡，將是癌癥治療的有效方法，具有重要的臨床應用前景。

基因治療是治療惡性腫瘤、遺傳性疾病(如重度聯合性免疫缺陷癥、囊性纖維病、遺傳性高膽固醇血癥、帕金森病)、心血管疾病的一種潛在治療方法，也是傳統癌癥化療的有效替代方法。基因治療通常包含以下幾個獨立的步驟：(1)目的基因導入受體；(2)目的基因向靶向細胞和細胞核的運輸；(3)目的基因的治療性產物的表達。應用裸露的dna直接進行基因治療目前還存在諸如血液循環系統中的半壽期短、被靶向細胞的吞噬效率低等障礙。因此，構建高效的基因傳輸體系和基因表達系統是基因治療成功的有力保障，也是其能否進入臨床和獲得療效的關鍵。

目前，基因傳輸載體包括轉錄病毒載體(retrovirus)、慢病毒載體(lentivirus)和腺病毒載體(adenovirus)和腺病毒相關載體(adeno-associatedvirus)，它們對大多數細胞系都有很高的轉染效率,其中由深圳賽百諾基因技術有限公司開發的基因治療藥物“今又生”就是由正常人的抑癌基因p53和改構的5型腺病毒基因重組而成；但是在應用過程中有很多弊病：(1)負載量低，特異性和靶向性差；(2)其本身具有免疫原性；(3)不易大規模生產，在臨床應用中受到限制的同時也帶來諸多安全隱患。同時，該類載體攜帶dna容量有限，靶向特異性差，且難于大規模制備，以上缺陷均限制其在臨床上的廣泛應用。

技術實現要素：

本申請通過高溫熱分解方法，合成ucnps@msio2-nh2，并對其基因轉染效率和細胞毒性等進行評價；通過化學鍵合技術，將組蛋白h2a與ucnps@msio2-nh2鍵合，構建ucnps@msio2-ss-h2a雜合基因載體材料；以介導p3xflag-cmv-p53質粒轉染p53基因缺失型(pc-3)、p53基因野生型(hela)細胞系，在細胞水平上研究其誘導腫瘤細胞凋亡的能力和分子機制；最后，通過體液免疫和細胞免疫兩方面的研究，系統評價該雜合基因載體材料的免疫原性。以上研究將制備一種基因轉染效率高、可視、安全無毒、具有靶向核定位能力的診療載體，將為惡性腫瘤的治療提供新的治療方法和手段。

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系，具有以下組成：ucnps@msio2-ss-h2a。

優選地，本發明所述具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系中，所述藥物與基因傳輸體系連接的靶基因為抑癌基因。

優選地，本發明所述具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系中，所述抑癌基因為p53。

本發明的另一目的在于提供一種制備具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系的方法，包括以下步驟：

1)、高溫熱分解反應合成ucnps@msio2-nh2；

2)、組蛋白h2a與交聯劑反應形成h2a-ss；

3)、加入活化劑對ucnps@msio2-nh2進行活化，將h2a-ss偶聯到活化的ucnps@msio2-nh2上，形成的具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系ucnps@msio2-ss-h2a；

優選地，本發明所述制備具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系的方法中，所述交聯劑為traut試劑。

優選地，本發明所述制備具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系的方法中，所述活化劑為琥珀酰亞胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸脂。

優選地，本發明所述制備具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系的方法中，所述具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系ucnps@msio2-ss-h2a，連接的基因為抑癌基因；更優選地，所述抑癌基因為p53基因；最優選地，所述p53基因為通過靜電作用連接。

本發明還提供了上述具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系在傳遞藥物與基因中的用途。

本發明與現有技術相比，本發明至少具有以下優點：

1)本發明的ucnps@msio2-ss-h2a雜合基因載體材料，選擇對小牛胸腺組蛋白h2a進行修飾，使該體系能夠作為基因載體，提升基因負載能力、降低載體毒性并兼顧靶向配體的作用；其次，本發明的ucnps@msio2-ss-h2a可以在同時傳遞藥物與基因的過程中，具有上轉換成像示蹤功能；最后本發明的ucnps@msio2-ss-h2a雜合基因載體材料能夠起到化學治療與基因治療的協同效應；

2)如本發明后續實施例所示，本發明的ucnps@msio2-ss-h2a雜合基因載體材料，以介導p3xflag-cmv-p53質粒轉染p53基因缺失型(pc-3)、p53基因野生型(hela)細胞系，在細胞水平研究其誘導腫瘤細胞凋亡的能力和分子機制；

其次，本發明通過體液免疫和細胞免疫兩方面的研究，系統評價該雜合基因載體材料的免疫原性，意外地發現本發明的基因載體材料，基因轉染效率高、可視、安全無毒，為具有靶向核定位能力的診療載體，將為惡性腫瘤的治療提供新的治療方法和手段。

說明書附圖

圖1為本發明一個實施例中的具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系ucnps@msio2-nh2合成的流程示意圖；

圖2為核殼結構的ucnps@msio2的透射電鏡圖(tem)；

圖3為氨基修飾的核殼結構ucnps@msio2-nh2的xps圖譜；

圖4為本發明一個實施例中的具有上轉換成像功能的藥物與基因傳輸體系攜帶p53基因的ucnps@msio2-ss-h2a/p53的合成示意圖；

圖5為ucnps@msio2-ss-h2a/p53納米顆粒凝膠電泳阻滯電泳圖；

圖6為ucnps@msio2-ss-h2a/pegfp-n3轉染hela細胞電鏡圖；

圖7為ucnps@msio2-ss-h2a/p53轉染hela、pc-3細胞活性圖；

圖8為對照(a)、pei25k(b)、ucnps@msio2(c)、h2a(d)、ucnps@msio2-ss-h2a(e)介導p53基因轉染hela(a)和pc-3(b)細胞凋亡圖。

具體實施方式

下面將結合本發明中的實施例，對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

(1)、通過高溫熱分解反應合成ucnps@msio2-nh2:

如圖1所示為本實施例中ucnps@msio2-nh2合成的流程示意圖，具體方法如下：

首先稱取2mmolcf3coona(272.5mg)，0.78mmol(cf3coo)3y(333.8mg),0.2mmol(cf3coo)3yb(102.4mg),0.02mmol(cf3coo)3er(10.13mg),一起加入含有10ml油胺的50ml的三頸瓶中。通入氬氣，劇烈攪拌下溫度逐漸升到160℃,并使該溫度持續1.5h，以便除去該體系中殘留的水和和氧氣。三氟稀土化合物充分溶解后會形成淡黃色均一溶液。然后，在氬氣的保護下使溫度持續升到330℃，在該溫度下反應3h。停止加熱終止反應，當反應體系自然降溫到80℃時加入20ml乙醇使之沉淀，在8000rmp條件下離心分離、重復洗滌3次。最后將所得納米粒子分散到10ml氯仿溶液中。得油胺穩定的nayf4:yb³⁺er³⁺(upconversionnanoparticles,ucnps)。

取1ml上述含有納米粒子的氯仿溶液，加入到10ml含有0.2gctab的水溶液中。劇烈攪拌后，使溶液的溫度逐漸升至60℃，使氯仿蒸發掉，獲得水分散的上轉換納米粒子(ucnps)。

將上述10ml水分散的納米粒子加入20ml蒸餾水，使總體積定容到30ml，加到50ml三角瓶中。然后，加入3ml無水乙醇，150μlnaoh(2m)，在水浴鍋中攪拌加熱至70℃后，加入200μlteos,在此溫度下繼續反應1h，停止反應自然降溫至室溫后，在8000rmp條件下離心分離、重復洗滌3次。最后將該納米粒子分散在10ml水溶液中。得核殼結構的ucnps@msio2。(見圖2為核殼結構的ucnps@msio2的透射電鏡圖(tem))

首先將44μl的aptes加到1ml的無水乙醇中，制備成的新鮮的aptes乙醇溶液。然后，取25μl上述溶液到10ml乙醇分散的納米粒子中，80℃回流加熱12h以上，自然冷卻至室溫，在8000rmp條件下離心分離、重復洗滌3次。得氨基修飾的核殼結構ucnps@msio2-nh2(如圖3所示為氨基修飾的核殼結構ucnps@msio2-nh2的xps圖譜，其中a)為氨基修飾前的xps圖譜；b)為氨基修飾后xps圖譜)。

(2)、將組蛋白h2a與traut試劑(2-iminothiolane·hcl)反應，合成組蛋白h2a-ss：

取10mgml^-1的組蛋白h2a加入到1ml的pbs緩沖液(含5mmoledta,ph:8.0)中，并與14mmol的traut試劑46μl充分混勻，室溫靜止1h。10,000rmp、10min離心收集，棄上清中多余的traut試劑，制備h2a-ss；(3)、通過琥珀酰亞胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸脂(n-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate,spdp)對ucnps@msio2-nh2進行活化，進而將組蛋白h2a-ss偶聯到ucnps@msio2-nh2上，形成新的復合物ucnps@msio2-ss-h2a；

取25μlspdp(20mm)加入到1ml含2mg的nayf4:yb³⁺er³⁺@msio2-nh2的pbs緩沖液(含5mmoledta,ph:8.0)中，室溫孵育60min。然后，與1mlh2a-ss的pbs緩沖液(含5mmoledta,ph:8.0)混合，4℃條件反應20h。最后，10,000rmp、10min條件下離心分離、重復洗滌3次，即得ucnps@msio2-ss-h2a。

(4)、ucnps@msio2-ss-h2a與p53基因通過靜電相互作用形成ucnps@msio2-ss-h2a/p53其中，p53基因為質粒plasmidsp3xflag-cmv-p53(編碼野生型p53蛋白)。如圖4所示，為實施例1制備ucnps@msio2-ss-h2a/p53的合成示意圖。

實施例2細胞實驗

1.凝膠阻滯實驗

實驗步驟：取2μl(500ngμl^-1)p3xflag-cmv-p53(實施例1制備)，分別按照0.2:1,0.3:1,0.4:1,0.5:1,0.6:1,0.7:1,0.8:1,0.9:1的體積比例加入ucnps@msio2-ss-h2a溶液，加入dna上樣緩沖液(10×)1μl，雙蒸水配平總體積為10μl，在室溫下充分混勻并孵育30min。在90v，1％瓊脂糖凝膠條件下電泳45min，之后置于245nm紫外燈下進行觀察。

實驗結果表明，如圖5(ucnps@msio2-ss-h2a/p53納米顆粒凝膠電泳阻滯)所示，將實施例1制備的ucnps@msio2-ss-h2a/p53進行凝膠阻滯實驗，當ucnps@msio2-ss-h2a/p53的比例大于0.8時，復合物不能向凝膠電泳的正極方向泳動，證明攜帶p53基因的載體完全與ucnps@msio2-ss-h2a納米粒子結合，具有很好的基因包裹能力。

2.ucnps@msio2-ss-h2a介導的體外基因轉染實驗

首先，將hela細胞以5×10⁴的密度鋪在6孔板中，并培養24h左右使其匯合度達到70％。去除每孔的培養基，并用1ml的pbs緩沖液淋洗3次，用含有2μgpegfp-n3的ucnps@msio2-ss-h2a/pegfp-n3無血清培養基孵育hela細胞6h。之后，再用含10％胎牛血清的新鮮培養基替換掉無血清培養基，繼續培養24h。最后，在熒光顯微鏡下觀察pegfp-n3綠色熒光蛋白在細胞內的表達情況。

如圖6所示，與pei25k和h2a相比，無論在有血清和無血清培養基中，ucnps@msio2-ss-h2a都展示出很好的基因轉染效率。這種基因效率的提升可能歸因于納米粒子與組蛋白h2a的結合提升了蛋白本身的穩定性，增加了復合物與細胞膜的緊密接觸與相互作用能力。

3.ucnps@msio2-ss-h2a介導的細胞增殖抑制作用

將hela和pc-3細胞以5×10³細胞/孔的密度接種于96孔細胞培養板中，每孔加入200μl含10％的胎牛血清的dmem中，在37℃、5％co2培養箱中培養24h。之后取200μl含ucnps@msio2-ss-h2a/p53(質量比為2:1，其中p53的量為0.2μg)的dmem替換每孔中10％的胎牛血清的dmem，同時設立pei25k、h2a作為對照。細胞在同樣條件下培養24h，每孔加入5mg/ml的mtt溶液10μl，37℃條件下孵育2h，吸去孔內所有液體，可見甲臜晶體形成于胞內。加入dmso150μl,震蕩10min使其甲臜充分溶解后，在495nm波長處測定其光吸收值。計算細胞存活率＝(試驗組吸光度/對照組吸光度)×100％。

如圖7(ucnps@msio2-ss-h2a/p53轉染hela、pc-3細胞活性圖)所示，與pei25k相比，ucnps@msio2-ss-h2a降低了細胞毒性，作用hela和pc-3細胞后，其細胞活性均大于90％。當ucnps@msio2-ss-h2a/p53轉染hela細胞時,細胞活性降低到40％左右。這種細胞活性的降低表明ucnps@msio2-ss-h2a介導的p53基因轉染能夠誘導細胞增殖的抑制。而ucnps@msio2-ss-h2a介導的p53基因的轉染所誘導pc-3細胞抑制作用要強于hela細胞。這可能是由于hela細胞含有野生型的p53基因，其外源p53基因的表達對內源細胞信號通路的影響較小；而pc-3細胞是p53基因突變型細胞系，外源p53基因在胞內的表達可能直接啟動了胞內的細胞信號通路，引起較強的細胞增殖抑制作用。

4.ucnps@msio2-ss-h2a介導的細胞凋亡作用

分別用pei25k、ucnps@msio2、h2a、ucnps@msio2-ss-h2a作為載體介導p53基因的轉染，如圖8所示(對照(a)、pei25k(b)、ucnps@msio2(c)、h2a(d)、ucnps@msio2-ss-h2a(e)介導p53基因轉染hela(a)和pc-3(b)細胞凋亡圖)，流式細胞術的結果分析表明：在pc-3和hela細胞中都誘導其早期凋亡作用的發生，其hela細胞的凋亡比例分別為2.42％、15.40％、16.36％、7.76％、20.16％；pc-3細胞的凋亡比例為0.08％、19％、27％、10％、40％。ucnps@msio2-ss-h2a介導的p53基因轉染所誘導的凋亡效果明顯強于pei25k、ucnps@msio2、h2a載體的介導作用，而且pc-3細胞比hela細胞更加敏感。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。