本發明屬于生物醫藥領域，尤其是涉及一種應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法。
背景技術：
肝癌是世界范圍內癌癥死亡率很高的常見腫瘤，據2012年全球癌癥統計(globecancerstactics)報告顯示：全世界2012年肝癌新發肝癌74.8萬人，在所有癌癥發病率中位列第六位；當年死亡69.5萬人，位于肺癌，胃癌之后，居第三位。在我國，其發病率位居所有惡性腫瘤的第四位，死亡率高居第二位，嚴重威脅我國人民健康和生命，且肝癌的發病率和死亡率呈逐年增加趨勢。
抗腫瘤藥物的“化療”法在肝癌的治療中占有重要的地位，但多數抗腫瘤藥物存在水溶性差、半衰期短、藥物全身分布和副作用大等缺陷。阿霉素是臨床常用的蒽環類抗惡性腫瘤藥物，其作用機理主要是該品嵌入dna而抑制核酸的合成。阿霉素抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，但其有嚴重的心臟毒性和骨髓抑制毒性。紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取出來的一種具有高效抗腫瘤活性的天然物質，可通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩定，抑制細胞有絲分裂。紫杉醇在水中的溶解性差，臨床應用的主要是紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑（taxol?制劑），但研究顯示聚氧乙烯蓖麻油在體內促使大量組織胺釋放，造成嚴重過敏反應、腎毒性及神經毒性等毒副反應。
納米粒子給藥系統是用各種不同材料制備得到的納米粒子包載化療藥物，可以顯著提高化療藥物的水溶性，延長藥物的體內半衰期，增加腫瘤組織中的藥物分布，同時減小對其他組織器官的毒性。
天然多糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，對人體無毒無刺激，廉價易得。疏水改性的天然多糖在水中發生自聚集，親水性多糖分散在納米粒子表面，它們不易與血液和組織成分發生作用，起到穩定作用；疏水性分子傾向于分布納米粒內核中，提供疏水空腔，可包載疏水性化療藥物。疏水改性的天然多糖載藥納米粒子具有分散性好、載藥量高以及制備方法簡單等優點，使其在納米給藥系統方面具有極大發展潛力。殼聚糖是自然界中大量存在的唯一一種堿性多糖，具有優良的生物相容性，生物可降解性，已在食品、醫療、生物技術和藥學等領域得到了廣泛的應用。
而在納米粒子表面修飾上一定量的靶向配體，通過靶向配體與癌細胞表面受體的特異性結合，實現主動靶向給藥，又可提高治療效率。去唾液酸糖蛋白受體(asgpr)是肝細胞特異性表達的受體，且是一種高效的內吞型受體，以半乳糖、半乳糖胺、n-乙酰半乳糖胺等為靶向基團的納米粒子可與asgpr特異性結合，可用于肝靶向給藥。
納米粒子作為藥物載體材料方面研究已經取得了很大突破，但仍然存在一些問題，如載藥納米粒子隨血液循環過程中包載的藥物容易泄漏，而到達腫瘤組織后，載藥納米粒子初期釋藥量不夠而降低了治療效果。近些年，環境敏感性給藥系統的研究取得了飛速發展，特別是具有ph敏感性納米給藥系統，可有效解決這些問題。人體正常體液環境以及細胞漿的ph值在7.4左右，腫瘤組織的ph值略低，大約在6.5-7.2，而細胞內涵體和溶酶體的ph值更低，大約在4-6.8。因此，可以利用人體內不同環境ph的變化來設計ph敏感性載藥納米粒子，降低載藥納米粒子在傳輸過程中的藥物泄露；而載藥納米粒子到達腫瘤組織、進入腫瘤細胞后，將包載的抗癌藥物大量釋放，這將有助于降低藥物副作用、提高藥物利用率，增強抑瘤作用。calderón等通過腙鍵將阿霉素偶聯在具有納米結構的樹枝狀大分子末端，其具有很好的酸敏感性，在ph7.4的釋放介質中，阿霉素總釋放量低于5%，而在ph4.0的釋放介質中，阿霉素總釋放量可達到80%，說明以腙鍵將阿霉素偶聯在聚合物膠束上可使載藥膠束釋藥具有ph敏感性。
為提高腫瘤的治療效果，臨床上可采用兩種或兩種以上化療藥物聯合的化療方案。將兩種不同抗癌機制的化療藥物同時遞送到腫瘤細胞，可降低兩種化療藥物的用藥劑量，又可有效增加治療效率。
迄今，以具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖為載體材料，包載具有肝靶向性的紫杉醇前藥，形成的納米粒子給藥系統尚未見相關文獻報道。
技術實現要素：
本發明設計了一種應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法，其解決了目前多數抗腫瘤藥物存在的水溶性差、半衰期短、藥物全身分布和副作用大等缺陷，同時本發明設計的納米粒子給藥系統原料廉價易得、制備方法簡單易重復、易于大規模生產，能夠大大提高肝癌的靶向治療效率。
為了解決上述存在的技術問題，本發明采用了以下方案：
一種應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統，其特征在于：其是用具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖包載肝靶向性紫杉醇前藥制成；其中，按照質量分數計，所述的具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖中載有藥物阿霉素的量為5%～20%，所述的肝靶向性紫杉醇前藥中載有藥物紫杉醇的量為2%～20％；所述的應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統粒徑為100nm～350nm。
進一步，所述的ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖的結構式如下：
進一步，所述的肝靶向性紫杉醇前藥的結構式如下：
一種應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統的制備方法，其特特征在于包含以下步驟：
步驟一、ph敏感性阿霉素修飾殼聚糖的制備
將殼聚糖和對羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干;將得到的凍干產品溶于二甲基亞砜，加入阿霉素，避光，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干，得到具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖，得到產品記為dox-cts;
步驟二、具有肝靶向性紫杉醇前藥制備
將紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室溫反應24h～72h，旋干，柱純化，得到產品記為ptx-cooh；
將一端為羧基、另一端為叔丁氧基羰基保護氨基的聚乙二醇（記為hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干；將得到的凍干產品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室溫反應24h～48h，對水透析，凍干，得到產品記為gal-peg-nh2；
將ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二環己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，過濾除去沉淀，對水透析，凍干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前藥，產品記為gal-peg-ptx;
其中，步驟一和步驟二的先后順序可以進行置換；
步驟三、肝靶向ph敏感性納米粒子的制備
將gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分攪拌，超聲處理0.5h-2h之后，對水透析3～7天，每天換水4次，凍干得到納米粒子，產品記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps。
進一步，所述步驟一中的殼聚糖的濃度為0.5mg/ml-5mg/ml，分子量為2000～100000，脫乙酰度為80%～100%；
所述步驟一中的殼聚糖結構單元與對羧基苯肼的摩爾比為1:0.1～0.4；
所述步驟一中的殼聚糖結構單元與阿霉素的摩爾比為1:0.05～0.3；
所述步驟一中的殼聚糖結構單元與催化劑的摩爾比為1:1～1.2。
進一步，所述步驟二中的紫杉醇的濃度為5mg/ml～30mg/ml；
所述步驟二中的紫杉醇和琥珀酸酐的摩爾比為1:1～5；
所述步驟二中的紫杉醇和吡啶的摩爾比為1:5～20。
進一步，所述步驟二中的hooc-peg-nh-boc的濃度為1mg/ml～5mg/ml；
所述步驟二中的hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩爾比為1:2～5；
所述步驟二中的hooc-peg-nh-boc與催化劑的摩爾比為1:1～1.2。
進一步，所述步驟二中的gal-peg-nh2的濃度為1mg/ml～5mg/ml；
所述步驟二中的gal-peg-nh2與ptx-cooh的摩爾比為1:2～5；
所述步驟二中的gal-peg-nh2與催化劑的摩爾比為1:1～1.2。
進一步，所述步驟三中的dox-cts的濃度為0.5～5mg/ml；
所述步驟三中的gal-peg-ptx的濃度為1～5mg/ml。
進一步，所述步驟三中所述的超聲處理步驟中，設定反應儀器的狀態為：的功率60w、溫度4℃～7℃、脈沖開2s停2s。
該應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法具有以下有益效果：
（1）本發明應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法中gal-peg-ptx/dox-ctsnps在藥物輸送過程中（ph=7.4），可穩定存在，能夠有效降低藥物泄露。
（2）本發明應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法中到達腫瘤組織后，gal-peg-ptx/dox-ctsnps可通過半乳糖受體介導的內吞方式進入肝癌細胞，在內涵體/溶酶體較低ph環境下（ph=4-6），腙鍵斷裂，納米粒解體，dox與cts在水中質子化均為電正性，靜電排斥，加速藥物釋放、提高藥物釋放量。
（3）本發明應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法中為加強對肝癌細胞的殺傷，包載了與dox抗癌機制不同的化療藥物ptx，本發明并不是簡單包載疏水性小分子ptx，而是包載了gal-peg-ptx，親水性gal-peg的引入不但可以起到肝靶向作用，也可以進一步提高納米粒子的生物相容性，另外，在納米粒子傳輸過程中，peg可與cts有一定的纏繞，則可降低ptx的藥物泄露。
（4）本發明應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法中制備的納米粒子原料廉價易得、制備方法簡單易重復、易于大規模加工生產，能夠大大增強肝癌的靶向治療效果，具有良好的應用前景。
本發明應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法是以具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖為載體材料，包載具有肝靶向性的紫杉醇前藥，提供一種同時包載兩種不同抗癌機制化療藥物阿霉素和紫杉醇、且具有肝靶向性和ph敏感性的納米粒子給藥系統及其制備方法，此種納米粒子在藥物輸送過程中可有效降低藥物泄露，到達腫瘤組織，納米粒子可通過半乳糖受體介導的內吞方式進入肝癌細胞，在內涵體/溶酶體較低ph環境下，腙鍵斷裂，納米粒解體，將兩種化療藥物同時釋放出來，達到聯合給藥治療肝癌的目的。
具體實施方式
本發明公開了一種應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法，下面結合具體實施例，對本發明做進一步說明：
實施例1
步驟一、ph敏感性阿霉素修飾殼聚糖的制備
將殼聚糖和對羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干;將得到的凍干產品溶于二甲基亞砜，加入阿霉素，避光，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干，得到具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖，得到產品記為dox-cts;其中，殼聚糖的濃度為0.5mg/ml，質量為50mg，分子量為2000～100000，脫乙酰度為80%～100%；殼聚糖結構單元與對羧基苯肼的摩爾比為1:0.1；殼聚糖結構單元與阿霉素的摩爾比為1:0.05；殼聚糖結構單元與催化劑的摩爾比為1:1。
步驟二、具有肝靶向性紫杉醇前藥制備
將紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室溫反應24h～72h，旋干，柱純化，得到產品記為ptx-cooh；其中，紫杉醇的濃度為5mg/ml，質量為100mg；紫杉醇和琥珀酸酐的摩爾比為1:1；紫杉醇和吡啶的摩爾比為1:5。
將一端為羧基、另一端為叔丁氧基羰基保護氨基的聚乙二醇（記為hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干；將得到的凍干產品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室溫反應24h～48h，對水透析，凍干，得到產品記為gal-peg-nh2；其中，hooc-peg-nh-boc的濃度為1mg/ml，質量為200mg；hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩爾比為1:2；hooc-peg-nh-boc與催化劑的摩爾比為1:1。
將ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二環己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，過濾除去沉淀，對水透析，凍干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前藥，產品記為gal-peg-ptx;其中，gal-peg-nh2的濃度為1mg/ml，質量為50mg；gal-peg-nh2與ptx-cooh的摩爾比為1:2；gal-peg-nh2與催化劑的摩爾比為1:1。
步驟三、肝靶向ph敏感性納米粒子的制備
將gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分攪拌，超聲處理0.5h-2h之后，對水透析3～7天，每天換水4次，凍干得到納米粒子，產品記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps。其中，dox-cts的濃度為0.5mg/ml；gal-peg-ptx的濃度為1mg/ml。
利用透射電鏡（tem,philips,em400st）觀察本發明得到的產物gal-peg-ptx/dox-ctsnps，再將記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps的產物通過激光粒度儀（brookhaveninstrumentscorporation,holtsville,ny,usa）進行表征，得到的粒徑分布范圍為100nm～350nm。
實施例2
步驟一、ph敏感性阿霉素修飾殼聚糖的制備
將殼聚糖和對羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干;將得到的凍干產品溶于二甲基亞砜，加入阿霉素，避光，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干，得到具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖，得到產品記為dox-cts;其中，殼聚糖的濃度為2mg/ml，質量為100mg，分子量為2000～100000，脫乙酰度為80%～100%；殼聚糖結構單元與對羧基苯肼的摩爾比為1:0.2；殼聚糖結構單元與阿霉素的摩爾比為1:0.1；殼聚糖結構單元與催化劑的摩爾比為1:1.1。
步驟二、具有肝靶向性紫杉醇前藥制備
將紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室溫反應24h～72h，旋干，柱純化，得到產品記為ptx-cooh；紫杉醇的濃度為10mg/ml；，質量為200mg紫杉醇和琥珀酸酐的摩爾比為1:2；紫杉醇和吡啶的摩爾比為1:10。
將一端為羧基、另一端為叔丁氧基羰基保護氨基的聚乙二醇（記為hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干；將得到的凍干產品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室溫反應24h～48h，對水透析，凍干，得到產品記為gal-peg-nh2；其中，hooc-peg-nh-boc的濃度為2mg/ml，質量為400mg；hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩爾比為1:3；hooc-peg-nh-boc與催化劑的摩爾比為1:1.1。
將ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二環己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，過濾除去沉淀，對水透析，凍干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前藥，產品記為gal-peg-ptx;其中，gal-peg-nh2的濃度為2mg/ml，質量為100mg；gal-peg-nh2與ptx-cooh的摩爾比為1:3；gal-peg-nh2與催化劑的摩爾比為1:1.1。
步驟三、肝靶向ph敏感性納米粒子的制備
將gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分攪拌，超聲處理0.5h-2h之后，對水透析3～7天，每天換水4次，凍干得到納米粒子，產品記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps。其中，dox-cts的濃度為2mg/ml；gal-peg-ptx的濃度為2mg/ml。
利用透射電鏡（tem,philips,em400st）觀察本發明得到的產物gal-peg-ptx/dox-ctsnps，再將記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps的產物通過激光粒度儀（brookhaveninstrumentscorporation,holtsville,ny,usa）進行表征，得到的粒徑分布范圍為100nm～350nm。
實施例3
步驟一、ph敏感性阿霉素修飾殼聚糖的制備
將殼聚糖和對羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干;將得到的凍干產品溶于二甲基亞砜，加入阿霉素，避光，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干，得到具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖，得到產品記為dox-cts;其中，殼聚糖的濃度為2mg/ml，質量為200mg，分子量為2000～100000，脫乙酰度為80%～100%；殼聚糖結構單元與對羧基苯肼的摩爾比為1:0.3；殼聚糖結構單元與阿霉素的摩爾比為1:0.2；殼聚糖結構單元與催化劑的摩爾比為1:1.2。
步驟二、具有肝靶向性紫杉醇前藥制備
將紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室溫反應24h～72h，旋干，柱純化，得到產品記為ptx-cooh；紫杉醇的濃度為20mg/ml，質量為400mg；紫杉醇和琥珀酸酐的摩爾比為1:4；紫杉醇和吡啶的摩爾比為1:15。
將一端為羧基、另一端為叔丁氧基羰基保護氨基的聚乙二醇（記為hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干；將得到的凍干產品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室溫反應24h～48h，對水透析，凍干，得到產品記為gal-peg-nh2；其中，hooc-peg-nh-boc的濃度為3mg/ml，質量為400mg；hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩爾比為1:4；hooc-peg-nh-boc與催化劑的摩爾比為1:1.2。
將ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二環己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，過濾除去沉淀，對水透析，凍干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前藥，產品記為gal-peg-ptx;其中，gal-peg-nh2的濃度為3mg/ml，質量為150mg；gal-peg-nh2與ptx-cooh的摩爾比為1:4；gal-peg-nh2與催化劑的摩爾比為1：1.2。
步驟三、肝靶向ph敏感性納米粒子的制備
將gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分攪拌，超聲處理0.5h-2h之后，對水透析3～7天，每天換水4次，凍干得到納米粒子，產品記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps。其中，dox-cts的濃度為4mg/ml；gal-peg-ptx的濃度為3mg/ml。
利用透射電鏡（tem,philips,em400st）觀察本發明得到的產物gal-peg-ptx/dox-ctsnps，再將記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps的產物通過激光粒度儀（brookhaveninstrumentscorporation,holtsville,ny,usa）進行表征，得到的粒徑分布范圍為100nm～350nm。
實施例4
步驟一、ph敏感性阿霉素修飾殼聚糖的制備
將殼聚糖和對羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干;將得到的凍干產品溶于二甲基亞砜，加入阿霉素，避光，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干，得到具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖，得到產品記為dox-cts;其中，殼聚糖的濃度為5mg/ml，質量為300mg，分子量為2000～100000，脫乙酰度為80%～100%；殼聚糖結構單元與對羧基苯肼的摩爾比為1:0.4；殼聚糖結構單元與阿霉素的摩爾比為1:0.3；殼聚糖結構單元與催化劑的摩爾比為1:1.2。
步驟二、具有肝靶向性紫杉醇前藥制備
將紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室溫反應24h～72h，旋干，柱純化，得到產品記為ptx-cooh；紫杉醇的濃度為30mg/ml，質量為400mg；紫杉醇和琥珀酸酐的摩爾比為1:5；紫杉醇和吡啶的摩爾比為1:20。
將一端為羧基、另一端為叔丁氧基羰基保護氨基的聚乙二醇（記為hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，對水透析，凍干；將得到的凍干產品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室溫反應24h～48h，對水透析，凍干，得到產品記為gal-peg-nh2；其中，hooc-peg-nh-boc的濃度為5mg/ml，質量為400mg；hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩爾比為1:5；hooc-peg-nh-boc與催化劑的摩爾比為1:1.2。
將ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二環己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的等摩爾比混合物為催化劑，室溫反應24h～72h，過濾除去沉淀，對水透析，凍干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前藥，產品記為gal-peg-ptx;其中，gal-peg-nh2的濃度為5mg/ml，質量為200mg；gal-peg-nh2與ptx-cooh的摩爾比為1:5；gal-peg-nh2與催化劑的摩爾比為1:1.2。
步驟三、肝靶向ph敏感性納米粒子的制備
將gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分攪拌，超聲處理0.5h-2h之后，對水透析3～7天，每天換水4次，凍干得到納米粒子，產品記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps。其中，dox-cts的濃度為5mg/ml；gal-peg-ptx的濃度為5mg/ml。
利用透射電鏡（tem,philips,em400st）觀察本發明得到的產物gal-peg-ptx/dox-ctsnps，再將記為gal-peg-ptx/dox-ctsnps的產物通過激光粒度儀（brookhaveninstrumentscorporation,holtsville,ny,usa）進行表征，得到的粒徑分布范圍為100nm～350nm。
本發明應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法的作用原理是：
利用具有ph敏感性的腙鍵將疏水性抗癌藥物阿霉素偶聯在殼聚糖上，制備出具有ph敏感性的阿霉素修飾殼聚糖；另外，將聚乙二醇一端修飾上具有肝靶向性的親水性小分子半乳糖，另一端利用易水解斷裂的脂鍵偶聯疏水性抗癌藥物紫杉醇，制備具有肝靶向性的紫杉醇前藥。阿霉素修飾殼聚糖在水中可自聚集形成納米粒子，疏水空腔可以包載肝靶向性紫杉醇前藥中的疏水端紫杉醇，而親水鏈段半乳糖化聚乙二醇可以伸展到納米粒表面，得到具有ph敏感性和肝靶向納米粒子，同時包載了阿霉素和紫杉醇。其提供一種同時包載兩種不同抗癌機制化療藥物阿霉素和紫杉醇、且具有肝靶向性和ph敏感性的納米粒子給藥系統及其制備方法，此種納米粒子在藥物輸送過程中可有效降低藥物泄露，到達腫瘤組織，納米粒子可通過半乳糖受體介導的內吞方式進入肝癌細胞，在內涵體/溶酶體較低ph環境下，腙鍵斷裂，納米粒解體，將兩種化療藥物同時釋放出來，達到聯合給藥治療肝癌的目的。
本發明應用于肝癌化療聯合給藥的肝靶向ph敏感性納米粒子給藥系統及其制備方法中制備的納米粒子原料廉價易得、制備方法簡單易重復、易于大規模加工生產，能夠大大增強肝癌的靶向治療效果，具有良好的應用前景。
上面結合具體實施例對本發明進行了示例性的描述，顯然本發明的實現并不受上述方式的限制，只要采用了本發明的方法構思和技術方案進行的各種改進，或未經改進將本發明的構思和技術方案直接應用于其它場合的，均在本發明的保護范圍內。